Optogenetics של דגי זברה: הפעלת נוירון סומטוסנסורי מהונדס גנטית לחקר תגובות התנהגותיות של זחלים

תקציר

מקור: Palanca A. M. S., et al. הפעלה אופטוגנטית של נוירונים סומטוסנסוריים של דגי זברה באמצעות ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

סרטון זה מתאר טכניקות אופטוגנטיות על ידי הפעלת נוירונים סומטוסנסוריים מהונדסים גנטית ורישום תגובה התנהגותית מעוררת באמצעות מצלמת וידאו במהירות גבוהה.

פרוטוקול

1. הר הזחלים לניסויי התנהגות

1. הכינו אגרוז נמס נמוך ב-1.5% ב-ddH2O ואחסנו בבלוק חום של 42°C כדי למנוע ממנו להתמצק.
2. בעזרת פיפטה פסטר מזכוכית, מעבירים את אחד הזחלים שהוקרנו מראש לתוך צינור של אגרוז נמס נמוך 1.5% עם כמה שפחות מים כחולים/עובריים.
3. מעבירים את הזחלים בטיפת אגרוז לצלחת פטרי קטנה.
4. תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את הזחל הגבי כלפי מעלה.
5. כאשר האגרוז התמצק, חתכו את האגרוז עם סכין גילוח דק (אזמל #11), והותירו טריז של אגר סביב הזחל כולו.
6. עשו שני חתכים אלכסוניים משני צדי החלמון; היזהרו לא לנקב את הזחל.
7. מלאו את האזור המקיף את האגרוז במים עובריים/כחולים.
8. משכו את האגרוז הרחק מהגזע והזנב של הזחל (איור 1).

2 . הכנת מצלמה מהירה ותוכנת הדמיה

1. הרכיבו מצלמה במהירות גבוהה על טווח ניתוח.
2. חבר מצלמה למחשב.
3. הפעל את המחשב.
4. הפעל מצלמה במהירות גבוהה.
5. פתח תוכנת וידאו/הדמיה (אנו משתמשים בתוכנת הדמיה AOS ונתאר את הליכי השימוש בה כאן, אך תוכנות הדמיה אחרות מקובלות באותה מידה).
6. התאם את הגדרות המצלמה בהתאם (כלומר, 1,000 פריימים לשנייה (fps), מאגר הדק של 50% או הגדרות מועדפות אחרות).
7. התחל להקליט.

3. הפעלת תאי עצב בודדים באמצעות לייזר 473 ננומטר

1. חבר מגרה, לייזר וכבל אופטי.
2. הפעל את המגרה.
3. הגדר את הממריץ למקסימום של 5 וולט ומשך דופק של 5 מילישנייה.
4. הפעל לייזר בהתאם להוראות היצרן.
5. השתמשו במיקרוסקופ מנתח כדי למקם את קצה הכבל האופטי ליד גוף התא של תא עצב עם ביטוי ChEF-tdTomato (איור 1).
6. ספק פולס של אור כחול כדי להפעיל נוירון חושי.
7. הקלט התנהגות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה המוגדרת ל- 500 או 1,000 פריימים לשנייה.
8. חזור על הניסוי כרצונך, המתן דקה אחת בין כל הפעלה כדי למנוע הרגלה. (אנו רושמים לפחות שלוש תגובות לכל תא עצב).
9. כדי לשחרר זחלים, לחטט agarose עם מלקחיים, נזהר לא לפגוע החיה. ניתן לאפשר לבעל חיים זה להתפתח עוד יותר וניתן לחזור על ההליך בשלב מבוגר יותר כדי לאפיין את התפתחות ההתנהגות. ניתן גם להרכיב מחדש את העובר לצורך הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של התא המופעל כדי לתאם התנהגות עם מבנה תאי, כמתואר להלן.
10. מעבירים את הזחל לצלחת התרבית עם מים כחולים/עובריים טריים. אנו משתמשים בצלחת של 24 בארות כדי לעקוב אחר זחלים בודדים.

תוצאות

איור 1. דיאגרמה של זחל דג זברה רכוב ותאי עצב מייצגים המעורבים בתגובת מגע הזחל. זחלי דגי הזברה הורכבו חלקית באגרוז נמס נמוך של 1.5% (המיוצג על ידי קווים מקווקווים המקיפים את החלק הרוסטרלי של הזחל). נוירון טריגמינלי (בראש) ונוירון רוהון-זקן (בתא המטען) מתוארים באדום. תאי מאוטנר מתוארים בקווים מקווקווים בזחל. הכבל האופטי (לבן) מוצג ממוקם מעל גוף תא העצב RB.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז נמס נמוך	סיגמא	A9045	או שווה ערך
צלחת פטרי (100x15 מ"מ)	כלשהו	כלשהו
להבי אזמל לא סטריליים	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	או שווה ערך
מים כחולים/עובריים			10 ליטר ddH2O 0.6 גרם אינסטנט אושן 6 טיפות מתילן כחול
מצלמה במהירות גבוהה	AOS טכנולוגיות, Inc.	X-PRI (130025-10)	או שווה ערך
פיפטה פסטר זכוכית	פישר	1367820ב	או שווה ערך (קוטר 10-15 מ"מ)
לייזר נייד 473 ננומטר	לייזר קריסטל	CL-473-050	או עוצמה גבוהה יותר, עם אפשרות TTL
S48 ממריץ	חטיבת מכשירי הדשא של Astro-Med, Inc.	S48K	או שווה ערך
טריקאין	סיגמא	A5040
200 מיקרומטר סיבים אופטיים	ThorLabs	AFS200/220Y-מותאם אישית	כבל תיקון, אורך: 3 מ ', סוף A: FC / PC, קצה B: FC / PC, מעיל: FT030
50 מיקרומטר סיב אופטי	ThorLabs	AFS50/125Y-מותאם אישית	כבל תיקון, אורך: 3 מ ', סוף A: FC / PC, קצה B: FC / PC, מעיל: FT030
24 צלחות תרבות	ג'נסי	25-102	או שווה ערך