דיסקציה של עדשת העין: טכניקה לצפייה במורפולוגיה של עדשת דג הזברה

תקציר

מקור: Vorontsova I. et al, הערכה של לוקליזציה של גרעין עדשת דג זברה ושלמות סוטורלית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול שפותח כדי לנתח עדשות של דגי זברה בוגרים וזחלים כדי לנתח את המורפולוגיה של העדשה הקורטיקלית ואת השלמות המבנית של תפרי העדשה.

פרוטוקול

1. דיסקציה של עדשות זחלים ודגי זברה בוגרים

1. מרדימים דגים מ 6 זחלי dpf לבגרות עם tricaine עד שאינם מגיבים למגע אבל עדיין מראה דופק חזק. מדידת אורך סטנדרטי של דגים לפי שילינג (2002) לבימוי.
2. הבלו מיד את העיניים באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה והכניסו לצלחת דיסקציה ב-PBS (איור 1 מוצג עבור עיניים בוגרות).
   1. הכינו צלחת 35 מ"מ בהתאמה אישית מלאה בסיליקון לנתיחות עדשות. לאחר שקיעת הסיליקון, הוציאו דיווט בקוטר של 2-3 מ"מ ובעומק 0.5 מ"מ לשיתוק עיניים/עדשות בוגרות במהלך נתיחה.
3. דיסקציה של עדשות דגי זברה בוגרים
   1. הכניסו עין בוגרת לתוך המנה divot posterior side up מלא PBS. לשתק את העין על ידי החדרת מלקחיים בזווית של <45° דרך דיסק הראייה. היזהרו לא לדחוס או לדחוס את העדשה. בצע שניים או שלושה חתכים רדיאליים דרך הרשתית וסקלרה מהדיסק האופטי לאזור הריסים עם מספריים דיסקציה.
   2. מקלפים לאחור את הרשתית ואת לובן העין כמו עלי כותרת של פרחים והופכים את העין, הקרנית כלפי מעלה. לשתק את העדשה בעקיפין באמצעות מניפולציה של לובן העין והקרנית עם הצד השטוח של המספריים, תוך משיכת הרשתית ורקמות מחוברות עם מלקחיים. בזהירות לחתוך רקמה עודפת מן העדשה.
      הערה: חשוב לנתח בזהירות כדי לקבל עדשות בריאות באופן עקבי.
4. דיסקציה של עדשות זברה זחל
   1. הניחו את הצד האחורי של עין הזחל כלפי מעלה על החלק השטוח של צלחת הסיליקון המלאה ב-PBS והשתמשו במחט טונגסטן מושחזת כדי לבצע חתכים רדיאליים דרך הרשתית ולובן העין תוך כדי שיתוק העין עם מחט טונגסטן נוספת או מלקחיים.
      הערה: היזהרו שלא לפגוע בעדשה.
      1. יש לחדד אלקטרוליטית את קצה חוט טונגסטן בקוטר 2 ס"מ בקוטר 0.1 מ"מ על-ידי השעיית קצה החוט ל-10% (w/v) NaOH והפעלת זרם חילופין במתח נמוך14. הדקו את המחט לפיפטת פסטר על ידי המסת קצה הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.
         הערה: ניתן להשתמש גם בכלי דיסקציה עדינים חלופיים.
         זהירות: NaOH הוא קורוזיבי.
   2. גרפו בעדינות את העדשה מהעין המנותקת עם צד קהה של המחט, ומשכו בזהירות את הרקמה המצורפת.

תוצאות

איור 1: דיסקציה של עדשת דג זברה. (A) העיניים מנותחות מדגים מורדמים וממוקמות בצד האחורי כלפי מעלה (B). (C) העיניים משותקות על ידי מלקחיים דרך הדיסק האופטי (od) ושניים עד שלושה חתכים רדיאליים מבוצעים ברשתית ובסקלרה מהדיסק האופטי לזונולים. (D) קפלו את הדשים החוצה כדי לחשוף את העדשה. (E) סו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט (PBS)	פישר סיינטיפיק	BP399
צלחת מיקרווול תחתונה מזכוכית (צלחת פטרי 35 מ"מ, מיקרווול 14 מ"מ, #1.5 כיסוי)	תאגיד MatTek	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 מלקחיים	Dumont & Fils		יש לחדד את המלקחיים
מספריים מיקרו-דיסקציה Vannas	טד פלה בע"מ	1346	קצוות ישרים חדים/חדים
מיקרוסקופ קונפוקלי	ניקון		ליקוי חמה Ti-E
סודיום הידרוקסיד חרוזים	פישר סיינטיפיק	S612-3	זהירות - קורוזיבי/מגרה לעיניים ולעור, איבר המטרה - כתב עת לניסויים ויזואליים www.jove.com זכויות יוצרים © 2019 Journal of Visualized Experiments עמוד 2 מתוך 2 מערכת הנשימה, קורוזיבי למתכות
פיפות זכוכית פסטר חד פעמיות	פישרברנד	13-678-20א