אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

תקציר

מקור: Roy, B., et al. Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells. J. Vis. Exp. (2013).

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

פרוטוקול

1. הקלטת מהדק תיקון (מצב תא שלם)

1. כל ההקלטות מבוצעות במצב מהדק תיקון התא כולו. תאי הקלטה ממוקמים על במת מיקרוסקופ במערך אלקטרופיזיולוגי. השלבים שלנו קבועים ומיקרוסקופ מהדק טלאי זקוף מוברג לפלטפורמת מיקרוסקופ ניידת או למתרגם מיקרוסקופ.
2. פיפטות מהדק טלאי נמשכות על מושך אופקי (P-97; סאטר אינסטרומנטס ושות') מזכוכית בורוסיליקט בעלת דופן דקה המתקבלת מ-WPI. קוטר קצה פיפטה הוא בסדר גודל של 0.2-0.4 מיקרומטר לאחר ליטוש אש לקצה חלק, ואורך השוק הוא ~ 4 מ"מ.
3. חברו את הפיפטה לשלב ראש המגבר במערך האלקטרופיזיולוגיה. חשוב לשמור על במת הראש בזווית של כ-45° לציר האופקי מכיוון שהדבר מבטיח זווית כניסה לפיפטה המתאימה להיווצרות אטמים בעלי התנגדות גבוהה לתא מאוטנר.
4. רגע לפני הכניסה לתמיסת האמבטיה, הפעילו כמות קטנה של לחץ חיובי על פיפטה כדי להפחית את הסיכוי ללכלך את הקצה. בעת הקלטת mEPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים 1 μM TTX כדי לחסום פוטנציאלי פעולה, 5 μM סטריכנין כדי לחסום קולטני גליצין ו 10 μM bicuculline או 100 μM picrotoxin כדי לחסום קולטני GABAA. בעת הקלטת mIPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים 1 מיקרומטר TTX, חומצה kynurenic או bicuculline או סטריכנין בהתאם לפעילות הקולטן של עניין.
5. התקרב לתא M עם כמות קטנה של לחץ חיובי בפיפטה. הלחץ החיובי דוחף בעדינות את התא מצד לצד וכאשר הוא ממוקם מיד מעל התא, יוצר גומה קטנה על קרום התא. השאירו את הפיפטה במקומה למשך מספר שניות כדי לנקות בעדינות את פני התא, כך שניתן יהיה ליצור אטימה חזקה בין הפיפטה לממברנה. שחרור הלחץ החיובי בפיפטה מאפשר להתחיל את האטימה וכמות קטנה של לחץ שלילי יחד עם פוטנציאלי פיפטה שליליים גורמת להיווצרות אטמי GigaΩ תוך מספר שניות.
6. שנה את פוטנציאל ההחזקה במגבר ל- -60 mV. קרע את קרום התא עם סדרה של פולסים קצרים של יניקה. רשום באופן מיידי פוטנציאלים של ממברנות ומזער את תוצרי הקיבול. פיצוי על קיבוליות התא (Cm) והתנגדות הגישה (סדרתית) (Ra) ב- 70-85%. Ra צריך להיות במעקב שגרתי, כל 30 שניות עד דקה, ואם יש שינוי של 20% או יותר, לבטל את הניסוי.
7. לאחר שהניסוי הסתיים והושגו מספיק נתונים, ההכנה מוקרבת על ידי הסרת המוח האחורי עם זוג מלקחיים. בשלב זה, ניתוח נתונים יכול להתחיל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פיפטה פולר	סאטר אינסטרומנטס ושות	P-97
מיקרוסקופ מהדק טלאי זקוף	לייקה מיקרוסיסטמס	DMLFSA
מגבר	התקנים מולקולריים	200 ב'
מיקרומניפולטור	סיסקיו בע"מ	MX7500