הזרקה תוך שרירית (IM): העברת תרכובת לשריר הגבי של דג זברה בוגר

תקציר

מקור: Myllymäki, H., et al. חיסון דגי זברה בוגרים לסינון פרה-קליני של חיסונים מבוססי DNA. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הזרקה תוך שרירית להעברת תרכובות לשרירים הגביים של דג זברה בוגר.

פרוטוקול

1. הזרקת חיסון DNA ואלקטרופורציה

1. לחיסונים על פי פרוטוקול זה, יש להשתמש בדגי זברה בוגרים בריאים בני 6 עד 12 חודשים. שמור את הדגים במערכת זרימה עם מחזור אור/חושך של 14/10 שעות, עם מקסימום שבעה דגים לכל ליטר אחד של מים.
2. הכינו תמיסת אתיל אסטר (טריקאין) 0.02% חומצה 3-אמינובנזואית (pH 7) במיכל להרדמת הדגים. השתמשו בכלי פטרי בקוטר 10 ס"מ או משהו דומה.
3. הכינו מיכל התאוששות על ידי מילוי 5 ליטר במי מערכת נקיים 3 ליטר
.
4. הכינו ריפוד חיסונים כדי לשמור על הדגים במצב קבוע במהלך החיסון. קח 5 x 7 ס"מ² חתיכות של ספוג בעובי 2 עד 3 ס"מ. חותכים חריץ לתוך הספוג עם להב אזמל או מספריים חדים.
   הערה: ניתן להשתמש באותו ריפוד חיסונים במספר ניסויים. יש לחטא את הספוג בין הניסויים על ידי השרייתו ב-70% אלכוהול אתילי ולאפשר לו להתייבש.
5. משרים היטב את הספוג במי המערכת ומניחים את הספוג על צלחת פטרי.
6. צמו את הדג 24 שעות לפני החיסונים.
7. הרדימו דג זברה אחד על ידי הנחתו על צלחת פטרי המכילה 0.02% טריקאין. חכו עד שהדג לא יגיב לגירוי מגע ועד שלא תהיה תנועה של הזימים. מרדימים דג בודד בכל פעם.
8. בעזרת כף פלסטיק, מעבירים את דג הזברה המורדם לספוג הרטוב ומניחים את הצד הגחוני של הדג כלפי מטה לתוך החריץ. בתנוחה הנכונה, ודא שהראש ורוב הגוף של הדג נמצאים בתוך החריץ והסנפיר הגבי והזנב בולטים החוצה מהחריץ.
9. מתחת למיקרוסקופ, הניחו בזהירות את המחט בזווית של כ-45 מעלות קרוב לשריר הגבי של דג הזברה, תוך שימוש בגלגלי הכוונון העדין של ציר X ו-Y על המיקרומניפולטור.
10. מצא את הנקודה הקטנה ללא קשקשים מול סנפיר הגב, שם דחיפת המחט אינה דורשת כוח. אם מורגשת התנגדות, נסה נקודה סמוכה. הימנע מפגיעה בעמוד השדרה, בסנפיר הגבי או בקשקשים.
    הערה: אם המחט מתכופפת תוך כדי דחיפה, קצרו מעט את המחט על ידי חיתוך.
11. השתמש במתג כף הרגל כדי להזריק בהדרגה את תמיסת החיסון לתוך השריר. שימו לב לזריקה דרך המיקרוסקופ: פנול אדום נראה כשהוא נכנס לרקמת השריר. התאם את משך הדופק במידת הצורך.
    הערה: לחלופין, השתמש בלחצן יוזם הדופק בלוח הקדמי של המשאבה הפנאומטית לצורך ההזרקה. עם זאת, השימוש במתג רגל מרחוק מאפשר שימוש ביד השנייה להתאמת אורך הדופק על ידי גלגל החוגה בן 10 הסיבובים. הימנע הזרקת הפתרון מהר מדי, שכן זה עלול לגרום נזק מוגזם רקמות. הקפידו לא להזריק אוויר.
12. אלקטרופורציה של הדג מיד לאחר ההזרקה. ודא כי הדג עדיין תחת הרדמה. שמרו את הדג על הספוג ומקמו את הדג בין אלקטרודות מסוג טוויטר, כך שהאלקטרודות ממוקמות בכל צד של אתר ההזרקה. אין ללחוץ חזק מדי על פינצטת האלקטרודות, אך יש לשמור על שתי האלקטרודות במגע עם הדג.
    1. לחץ על לחצן ההפעלה באלקטרופורטור כדי לתת שש פעימות של 40 וולט, 50 אלפיות השנייה.
    2. מעבירים בעדינות את הדג למיכל ההתאוששות.
    3. נקה את האלקטרודות לאחר כל אלקטרופורציה על ידי החלקתן עם 70% אתנול.
       הערה: בזהירות לפקח על רווחתם של הדגים לאחר החיסון. יש להרדים כל דג המראה סימני אי נוחות (התאוששות איטית מהרדמה, שחייה חריגה, התנשמות) ב-0.04% טריקאין. לאחר ההתאוששות, העבירו את הדג ליחידת הזרימה והאכילו אותו כרגיל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פנול מלח נתרן אדום	סיגמא-אולדריץ'	114537-5G
טריקאין (אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן-סולפונט)	סיגמא	A5040-100 גרם	פתרון הרדמה והמתת חסד
פינצטה אלקטרודות (7 מ"מ) ערכות	BTX מכשיר הרווארד	BTX 450165	אלקטרודות מסוג פינצטה
נימי אלומיניום	מכשיר הרווארד	30-0108
מיקרומניפולטור	נארישיגה	MA-153
מיקרוסקופ	אולימפוס	ZS61
ECM אלקטרו מרובע פורטור	BTX מכשיר הרווארד	BTX ECM 830
כף פלסטיק
ספוג
שולחן עבודה מקלקר