מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

תקציר

מקור: Sorlien, E. L., et al. ייצור יעיל וזיהוי של נוקאאוטים גנטיים שנוצרו על ידי CRISPR/Cas9 במערכת המודל Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

פרוטוקול

1. מיקרו-הזרקה של רכיבי קריספר לעוברים של דגי זברה

1. הגדירו מיכלי רבייה בלילה שלפני ההזרקה על ידי הצבת מספר הזכרים והנקבות הרצויים (בדרך כלל 2 נקבות וזכר אחד או שניים) במיכל רבייה עם מחיצה במקום.
2. הכינו צלחת מיקרו-הזרקה עם 1.5% אגרוז במדיית E3 1x (ראו טבלת חומרים) עם 0.01% מתילן כחול (קוטל פטריות) על ידי מזיגת 35 מ"ל של האגרוז המומס לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ והניחו בעדינות תבנית פלסטיק כדי ליצור שקתות בצורת טריז לתוך התמיסה, תוך הקשה על התבנית כדי למנוע בועות אוויר.
3. מניחים לאגרוז להתייצב, ומאחסנים את התבשיל עם כמות קטנה של מדיה ועטופים בסרט פרפין כדי למנוע מהצלחת להתייבש ב-4°C.
   הערה: צלחות הזרקה ניתנות לשימוש חוזר במשך מספר שבועות, עד שהבארות מתעוותות או מתייבשות, או שהצלחת מתחילה להצמיח עובש.
4. בבוקר ההזרקה, הפשירו sgRNA מטוהר וחלבון Cas9 על קרח. זכור לטפל בכל החומרים עם כפפות כדי למנוע זיהום RNase ולהשתמש טיפים וצינורות ללא RNase.
5. צור תמיסת הזרקה של 5 μL על ידי שילוב של חלבון Cas9 ו- sgRNA ביחס של 2:1 של Cas9:sgRNA כדי לקבל ריכוזים סופיים של 400 pg/nL חלבון Cas9 ו- 200 pg/nL sgRNA. דגרו על תמיסת Cas9/sgRNA בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר ל-Cas9 ול-sgRNA ליצור קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין. הוסף 0.5 μL של 2.5% wt/vol פנול אדום תמיסה (ראה טבלה של חומרים), ומים נטולי RNase לנפח סופי של 5 μL.
   הערה: החוזק היוני של התמיסה הוכח כמשפיע על המסיסות של קומפלקס Cas9/sgRNA, ולכן תוספת של KCl עשויה להגביר את יעילות החיתוך של sgRNA המציגים היווצרות אינדל נמוכה.
6. צור מחט הזרקה על ידי משיכת נימי זכוכית 1.0 מ"מ באמצעות מושך מיקרופיפטה. חתכו את קצה המחט הטרייה באמצעות סכין גילוח חדשה או מלקחיים כדי לקבל פתח זוויתי שיחדור בקלות את שק הכוריון והחלמון.
7. הניחו את המחט במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק כאשר מקור האוויר מופעל. תחת מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה המתאימה לכיול שנקבע עבור המכשיר המסוים, להתאים את לחץ ההזרקה עד המחט פולטת באופן עקבי תמיסה 1 nL לתוך צלחת פטרי מלא שמן מינרלי.
   הערה: איכות המחט היא קריטית. תרגלו ייצור מחט והזרקה לתוך שק החלמון של עוברים עד לשליטה במיומנות זו לפני שתנסו ניסויים נוספים.
8. הסירו את המחיצה ואפשרו לדגים להתרבות במשך כ-15 דקות
   הערה: זמני רבייה ארוכים יותר יניבו יותר עוברים, אולם יש להשלים את ההזרקה בזמן שהעוברים נמצאים בשלב של תא אחד כדי למקסם את הסיכוי שחיתוך Cas9 יתרחש מוקדם ולכן יפחית את הפסיפס הגנטי. ניתן להזריק עוברים בשלבים מאוחרים יותר (2-4 שלבים של תאים), אך הדבר עשוי להפחית את קצב העברת קו הנבט של האלל שעבר שינוי.
9. אספו את הביצים באמצעות מסננת ושטפו אותן לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ באמצעות מדיה E3 1x עם 0.0001% מתילן כחול. לבחון את בריאות הביציות תחת מיקרוסקופ האור, להסיר ביצים לא מופרות ופסולת.
10. הניחו בצד 10-15 עוברים כקבוצת ביקורת בלתי מוגבלת בצלחת פטרי נפרדת ומסומנת.
11. בעזרת פיפטת העברה, מסדרים בעדינות את הביצים על צלחת ההזרקה המחוממת לטמפרטורת החדר.
12. תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה של פי 2.5, הזריקו 1 nL של התמיסה לתוך שק החלמון של כל עובר כדי להזריק סך של 400 pg של חלבון Cas9 ו 200 pg של sgRNA.
    הערה: כדי להגביר את החיתוך במידת הרצוי או הצורך, יש להגדיל את הריכוז הסופי של חלבון Cas9 ל-800 pg/nL ושל sgRNA ל-400 pg/nL בתמיסת ההזרקה; עם זאת, זה עלול גם להגדיל חיתוך מחוץ למטרה ו / או לפגוע בבריאות העובר. ניתן להגביר את יעילות החיתוך גם על ידי הזרקה ישירות לתא. עם זאת, הזרקה לתוך שק החלמון היא פחות תובענית מבחינה טכנית ונותנת חיתוך מספיק כדי לייצר דגים עם העברת נבט גבוהה (>70% מהצאצאים המכילים אלל שונה).
13. החזירו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת כראוי, כסו אותם במדיה 1x E3 בכחול מתילן, והכניסו אותם לאינקובטור עוברים שנקבע לטמפרטורה של 28°C.
14. 24 שעות לאחר ההפריה (hpf), בדקו את בריאותם של העוברים המוזרקים, הוציאו אנשים מתים או בעלי התפתחות חריגה ושנו את המדיה (ראו איור 1). בדוק את שיעור ההישרדות מול הבקרה הלא אחידה.
    הערה: כאשר מתמקדים בגן לא חיוני, צפויה פחות מ-10% קטלניות ביחס לקבוצת הביקורת הלא חיונית. אם רמות גבוהות של קטלניות נצפות באוכלוסיות המוזרקות על ידי המדריך בהשוואה לקבוצת הביקורת הלא ממוקדת, הדבר עשוי להצביע על כך שהגן הממוקד חיוני להתפתחות, או שהשפעות מחוץ למטרה מובילות להתפתחות כושלת. ייתכן שיהיה צורך להפחית את כמות ריאגנטי הקריספר המוזרקים או שיהיה צורך ביצירת sgRNA חדש עם השפעות מופחתות מחוץ למטרה.
15. להחזיר את העוברים לאינקובטור ולהמשיך לגדל את העוברים עד 72 hpf, לשנות את התקשורת מדי יום כדי לשמור על בריאות העובר.

תוצאות

תרשים 1: השוואת בריאותם של 24 עוברים מוזרקים HPF. עובר חי (A) שהתפתח ל-24 כ"ס, נבדל בקלות מעובר שהפיל את התפתחותו (B). עוברים הדומים ל-(B) או בעלי תכונות שהשתנו באופן דרסטי ל-(A), כגון עקמומיות עמוד השדרה או התפתחות ראש ועיניים שהשתנתה צריכים להיות מוסרים מהצלחת

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מים ללא RNase	כל מותג		סינתזה של רנ"א מנחה. Thermo פישר וקיאגן נושאים שניהם < /> מים מתאימים.
מדיה עוברית E3	תוצרת בית		מדיה לגידול עוברים ו ביצוע צלחת הזרקה. מתכון: תוכן http://cshprotocols.cshlp.org//2011/10/pdb.rec66449
מתילן כחול	סיגמא-אולדריץ'	M9140	נוסף למדיה E3 1x כדי למנוע צמיחה פטרייתית על עוברים.
צלחת פטרי	תרמו פישר	FB0875711Z	לאחסן עוברים, צלחת הזרקה יצוקה
אגרוז	דנוויל	CA3510-8	צלחת הזרקת יציקות, ג'ל אגרוז.
עובש מיקרו-הזקפה	כלים מדעיים אדפטיביים	טו-1	ליצור בארות שיחזיקו עוברים בזמן ההזרקה
פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	P0290	צבע להדמיה של הזרקה
שמן מינרלי	סיגמא-אולדריץ'	M5904-5ML	כדי לכייל את נפח הזרקת המחט.
העברת פיפטות	כל מותג		העברת עוברים
סכין גילוח	תרמו פישר	11295-10	חיתוך מחט הזרקה, גזיזת זנב דגים בוגרים.
אינקובטור			שמירה על עוברים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס.
מושך פיפטה אנכי	דוד קופף אינסטרומנטס	700ג	גנב מחטים להזרקה. הוראות נוספות למשיכת מחטים: http:// cshprotocols.cshlp.org/ תוכן/2006/7/pdb.prot4651.long
צינורות נימים	סאטר אינסטרומנטס	BF100-58-10	גנב מחטים להזרקה.
טיפים למעמיסים זעירים	אפנדורף	930001007	העמסת תמיסה לתוך מחטי הזרקה
מיקרו-מזרק	מכשירים מדויקים בעולם	PV 820	הזרקת עוברים.
מיקרוסקופ מנותק	לייקה		הזרקת עוברים.
מיקרוגל	כל מותג		צלחת הזרקת יציקות, ג'ל אגרוז.
סולם	כל מותג		צלחת הזרקת יציקות, ג'ל אגרוז.
כפפות	כל מותג		לכל היבטי הפרוטוקול.
N2	כל מותג		כדי לגרש נוזל מן הנימים עבור הזרקת העובר
צינורות רצועת PCR	כל מותג		לכל היבטי הפרוטוקול.
200 טיפים μL	כל מותג		לכל היבטי הפרוטוקול.
10 טיפים μL	כל מותג		לכל היבטי הפרוטוקול.
מיקרופיפטות	כל מותג		לכל היבטי הפרוטוקול.