דיסקציה של הלב: שיטה להתבוננות בהתפתחות הלב של דגי זברה

תקציר

מקור: Singleman C. et. al., דיסקציה של הלב בזחלים, דגי זברה צעירים ובוגרים, Danio rerio. J. Vis. Exp. (2011).

סרטון זה מתאר טכניקה של בידוד הלב מדגי זברה בשלבים התפתחותיים מרובים כדי לחקור התפתחות לבבית, התבגרות והזדקנות.

פרוטוקול

1. מדידת דגים ודיסקציה

1. הכניסו דג בודד לצלוחית פטרי מלאה למחצה ב-PBS טרי והניחו אותו על צדו הימני.
2. מדדו את אורך הדג מהחוטם ועד בסיס הזנב (הפדונקל הקאודלי), לא כולל סנפירי זנב, באמצעות קליפר מ"מ דיגיטלי (איור 1). זהו האורך הסטנדרטי (SL).
3. ניתן להקצות לכל דג שילוב של מספרים/אותיות כדי לאפשר מעקב אחר דג בודד ואחר הלב המנותח שנוצר לצורך ניתוח מאוחר יותר. נתונים, כולל מספר מלאי הורי, גיל בקיבוע, מדידות SL, הוזנו לגיליון אלקטרוני ואורגנו על בסיס תוויות אלה.
4. לפני הנתיחה, תייגו רצועות צינור PCR עם מספר מעקב שהוקצה ומלאו PBT או פתרון אחר המתאים לניתוח נוסף.
5. כיוון את הצד הגחוני של הדג כלפי מעלה בצלוחית פטרי תוך ייצוב הגוף באמצעות מלקחיים המחזיקים את הראש בין העיניים לזימים (איור 1).

דגים קטנים יותר (קטנים מ-12 מ"מ SL):

6. a) באמצעות מלקחיים חדים, או מיקרו-מחט במחזיק סיכות, הסר את שרירי החזה והסנפירים מהגוף כדי לחשוף את הלב. התנועה המתמדת של המלקחיים במהלך הדיסקציה עלולה לגרום לזרמים ב-PBT המניעים את הדג. זה בעייתי במיוחד עבור דגים קטנים יותר, ולכן מיקרו-מחט יכולה לשמש להסרת שרירי החזה והסנפירים ולפתוח את חלל הגוף.
7. א) השתמשו בעדינות במלקחיים כדי להוציא את הלב מהחלל מתחת לאטריום. לחילופין, בחלק מהדגים ייתכן שתוכלו להסיר את הלב על ידי משיכה עדינה של הבולבוס החוצה ושאר הלב יבוא בעקבותיו. היזהר ממיקום האטריום אם אתה משתמש בטכניקה זו מכיוון שהוא יכול להינזק בקלות. אם יש רקמה נוספת שמגיעה עם הלב, זה בסדר וניתן לנקות אחרי.
8. א) אם הדג מכיל סמן לב פלואורסצנטי כמו Tg(myl7:GFP)^twu34, השתמשו בטווח פלואורסצנטי לדיסקציה וודאו שהסרת הלב על-ידי תפרחת (איור 2).
9. א) לאחר הוצאת הלב מהחלל, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלב ובמיקרו-מחט כדי להסיר רקמה נוספת שאינה לבבית ואת רירית הלב מבחוץ של הלב.

דגים גדולים יותר (מעל 12 מ"מ SL):

6. b) באמצעות מיקרו-מספריים עם ידית קפיץ, בצעו שלושה חתכים בעומק של פחות מ-1 מ"מ: 1- חתך רוחבי דרך הזימים 2- חתך רוחבי בבטן הקדמית 3- חתך סגיטלי בצד הגחוני המחבר בין שני החתכים (איור 3).
7. ב) באמצעות מלקחיים חדים מוציאים את שרירי החזה והסנפירים מהגוף כדי לפתוח את חלל הגוף ולחשוף את הרקמה הכסופה של קרום הלב (איור 4A). הסירו את הרקמה הפריקרדיאלית הזו והלב ייראה לעין (איור 4B).
8. ב) השתמש במיקרו-מספריים כדי לחתוך את העורק המחובר לעורקים הבולבוסיים, הממוקם מעל הלב. ברגע שעורק זה נחתך, לשים את קצות המלקחיים מתחת אטריום, להשתמש במלקחיים כדי לגרוף את הלב מתוך החלל. אם יש רקמה נוספת שמגיעה עם הלב, זה בסדר וניתן להסיר אותה מאוחר יותר.
9. ב) לאחר הוצאת הלב מהחלל, השתמש בשתי המלקחיים כדי להחזיק את הלב ולהסיר רקמה נוספת, או זוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את הלב ומחט מיקרו כדי להסיר רקמה נוספת, שאינה לבבית. הרירית האפיקרדיאלית, המתבטאת בפיגמנטציה השחורה שלה, ניתנת להסרה מחוץ ללב אם רוצים בכך על ידי גירוד עדין של הרקמה.

תוצאות

איור 1.החזיקו את הדג עם מלקחיים בין העיניים לזימים.

איור 2.סמן פלואורסצנטי מהונדס ספציפי ללב, כגון Tg(myl7:GFP)^twu34, המוצג כאן, יכול לסייע בהדמיה של לבבות שנותחו מדגים קטנים יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלקחיים #55	כלים מדעיים משובחים	11295-51
מיקרו-מספריים	כלים מדעיים משובחים	15005-08
מחזיק סיכות	כלים מדעיים משובחים	26016-12
מיקרו-מחטים	כלים מדעיים משובחים	10130-10
צלחות פטרי	BD Biosciences	351029