1. הכנת תאים (עבור 10 עכברים)
הערה: יש לחסן את התאים תוך שעה לאחר ניתוקם מהצלחת כדי למנוע ירידה בכדאיות התא. באופן ספציפי, יש לערבב את תרחיף התאים בתערובת החלבונים הג'לטינית תוך 15 דקות לאחר ניתוק התאים מהצלחת כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם.
- תרבית 4T1-luc2 תאים, קו תאי אדנוקרצינומה חלב עכבר המבטא לוציפראז, במדיה RPMI 1640 עם 10% FBS באינקובטור לח ב 37 ° C ב 5% CO2.
- שטפו את תאי 4T1-luc2 הדבקים בכלי של 10 ס"מ עם מלח חוצץ פוספט (PBS) באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין באמצעות פיפטה P1000, ולאחר מכן, לדגור את הדגימה ב 37 ° C במשך 5 דקות. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של מדיה צמיחה (RPMI-1640 עם 10% FBS) באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל ולהעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי 15 מ"ל במכסה מנוע תרבית רקמה. צנטריפוגה את מתלה התא ב 180 x גרם במשך 5 דקות.
- שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את התאים ב -2 מ"ל של PBS; לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות ההמוציטומטר.
- להשהות 2 x 106 4T1-luc2 תאים ב 40 μL של PBS קר (pH 7.4, 4 ° C) במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
- ערבבו את תרחיף התאים 40-μL עם 360 μL של תערובת החלבונים הג'לטינית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח במכסה המנוע של תרבית הרקמה.
הערה: הריכוז הסופי הוא 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: תערובת חלבונים ג'לטינית). עבור המודל האורתוטופי (ללא כריתת שד), 1 x 104/20 μL של הריכוז הסופי שימש, כדי למנוע הגעה לקריטריונים המתת חסד (גודל הגידול > 2 ס"מ) בתוך שבועיים.
2. חיסון תאים סרטניים
- הכניסו את העכברים לתא השראת הרדמה עם 2-4% איזופלורן ו-0.2 ליטר/דקה זרימת חמצן עד שהעכברים ינשמו בשלווה (2-3 דקות).
- אחזו בעכבר והזריקו 0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין לכתפו באופן תת-עורי.
- לאשר הרדמה נאותה על ידי חוסר תגובה צביטת בוהן. הכניסו את אפו של העכבר לחור של מסכת העכבר, המאפשרת הרדמה בשאיפה עם 2-4% איזופלורן וזרימת חמצן של 2 ליטר/דקה המחוברת ליחידת מיכל פחם.
- יש לרסן את גפיו של העכבר באמצעות סרט מעבדה ולעקר את עורו באמצעות כלורהקסידין, יוד ואתנול 75%, באמצעות צמר גפן.
- בצע חתך עור 5 מ"מ באמצע דופן החזה הקדמית באמצעות מספריים מיקרודיסקציה סטריליים, להרים את העור בצד ימין ליד החתך ולנתק את העור מדופן החזה באמצעות המספריים, ולאחר מכן, להפוך את העור כדי לחשוף את כרית שומן החלב #2 הנכונה.
- הזריקו בזהירות 20 μL של תרחיף תאים סרטניים באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל עם מחט 28.5 G לתוך כרית השומן תחת ראייה ישירה דרך הפצע.
הערה: המחט עוברת דרך הפצע, לא דרך העור. המשיכו להחזיק את המחט בכרית השומן במשך 5 שניות לפני שליפתה, מה שמאפשר זמן לתערובת החלבונים הג'לטינית להתמצק.
- סוגרים את חתכי העור על ידי תפירה, באמצעות תפרים סטריליים 5-0 שאינם נספגים.
- לאחר הניתוח, יש להחזיר את בעלי החיים לכלוב נקי ולהשגיח עליהם עד שיתאוששו וינועו בחופשיות (לאחר ~1-2 דקות). אם נראה כי בעל החיים אינו במצב בריאותי תקין תוך 24 שעות מהניתוח, יש לתת בופרנורפין (0.2 מ"ג/ק"ג).
- הסר את התפרים בהרדמה (ראה שלב 2.1) 7 ד לאחר הניתוח.
