תרבית משותפת תלת-ממדית עם אינטראקציה ישירה: טיפוח משותף של תאים סרטניים עם מונוציטים כדי לחקור את האינטראקציה שלהם

תקציר

מקור: Espinoza-Sánchez, et al. ניתוח התקשורת בין מונוציטים ותאי סרטן שד ראשוניים במערכת תלת ממדית מבוססת תמצית מטריצה חוץ-תאית (ECME). J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את התרבית המשותפת התלת-ממדית של תאי סרטן השד עם מונוציטים כדי לחקור את האינטראקציה שלהם בסביבה מבוססת תמצית מטריצה חוץ-תאית (ECME). השיטה הזו עוזרת לחקור מאפיינים ספציפיים כמו פירוק קולגן, גיוס תאי מערכת החיסון ופלישה לתאים.

פרוטוקול

1. 3D תרבויות משותפות עם אינטראקציה ישירה

1. תייגו תאי BrC ומונוציטים בצבעים פלואורסצנטיים שונים לפני תרבית התא כדי לאפשר מיון עצמאי של כל שושלת תאים לאחר תרבית לצורך ניתוח mRNA וביטוי חלבונים. השתמש בנגזרות זמינות מסחרית של קומרין ורודמין העוברות בחופשיות דרך קרום התא של תאים חיים. להלן פרוטוקול כללי לתיוג:
   1. הכינו שכבה אחידה של תאי BrC מעניינים (2 × 10,⁶ תאים בצלוחית תרבית^{בגודל 25} ס"מ) והחליפו את המדיום הסטנדרטי בתמיסת עבודה מספיק מחוממת מראש של הצבע הפלואורסצנטי (1:2,000 של צבע פלואורסצנטי בתווך בסיס סטנדרטי ללא כל תוספת). יש לדגור 30 דקות ב-37°C בסביבה לחה של 5% CO₂. יש לשאוף את תמיסת הצבע ולשטוף בעדינות עם כמות מספקת של 1x PBS. שאפו את PBS והוסיפו את המדיום הסטנדרטי.
   2. טריפסיניזציה של monolayer התא עם 2 מ"ל של תמיסה של 0.05% טריפסין ו 0.48 mM EDTA במשך 5-10 דקות ב 37 ° C. הוסף 200 μL של FBS כדי לעצור טריפסיניזציה ו 7 מ"ל של המדיום הכתב ללא תוספים. להשהות מחדש את התאים על ידי pipetting. קח aliquot של 10 μL כדי לספור תאים בחדר נויבאואר. המשך עם פרוטוקול התרבית המשותפת לאחר ספירת תאים.
   3. גלולה את התאים ב 430 x גרם במשך 5 דקות ב RT (לבצע את זה הראשון מאז מונוציטים לגדול בהשעיה). יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש בעדינות תאים עם 3 מ"ל של תמיסת עבודה שחוממה מראש של הצבע הפלואורסצנטי (1:2,000 של הצבע הפלואורסצנטי בתווך בסיס סטנדרטי ללא תוספים). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה של 5% CO₂.
   4. גלול את התאים שוב, להשליך את תמיסת העבודה צבע, בעדינות resuspend עם 5-7 מ"ל של 1x PBS. גלולה שוב, להשליך את PBS, ולהשעות תאים ב 5-7 מ"ל של מדיום סטנדרטי. קח aliquot של 10 μL של תרחיף תאים כדי לספור תאים בתא נויבאואר. המשך עם פרוטוקול התרבית המשותפת לאחר ספירת תאים.
2. הגדר את התרבות המשותפת באופן הבא: פיזר מספיק ECME בתחתית הבאר כדי ליצור שכבה שווה בכל באר של מערכת שקופיות תא 4 בארות. צלחת 20 μL של תרחיף תא בודד המכיל 5 × 10⁵ תאי BrC מסומנים לכל באר.
3. לאחר 15-20 דקות של דגירה ב 37 ° C, להוסיף תרחיף של 2.5 x 10⁵ מונוציטים מסומנים ב 80 μL מבחן בינוני (בתוספת 60% ECME).
4. אפשר ECME להתמצק במשך 15-20 דקות ב 37 ° C.
5. הוסף 1 מ"ל של תערובת 1: 1 של תאי BrC ומדיה תרבית מונוציטים.
6. לדגור על תרביות משותפות בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה של 5% CO₂ למשך 24 שעות, 48 שעות או 5 ימים כדי לעקוב אחר שינויים בנקודות זמן שונות.
7. לפרק חלבוני ECM כדי לשחזר את התאים מהתרביות. לשאוף ולהשליך את המדיום, להוסיף 0.5 מ"ל של 1x PBS עם 0.1% טריפסין ו 0.25% EDTA, ולדגור במשך 3 שעות ב 37 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מ"ל של 1x PBS עם 10% FBS כדי לנטרל את טריפסין, ולהשעות מחדש את התאים על ידי pipeting נמרצות כדי לקבל תרחיף תא יחיד.
8. תאי גלולה ב 765 x גרם במשך 5 דקות ב RT, להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של 1x PBS עם 10% FBS. חזור על שלב זה פעם אחת.
9. יש להעביר את תרחיף התא למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) באמצעות המכשיר המתאים. לוודא שהאוכלוסיות הסופיות טהורות לפחות ב-95%).
10. לאחר המיון, לשטוף את התאים עם סטרילי 1x PBS, גלולה (430 x גרם במשך 5 דקות ב RT), ו resuspend סטרילי 1x PBS. תאים יכולים להיות מעובדים על פי פרוטוקולים ספציפיים לבידוד RNA או ניתוח חלבונים.
11. חזור על כל בדיקה שלוש פעמים, כולל תרביות תלת-ממדיות של כל שושלת תאים בודדת כבקרה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
U937	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	CRL-1593.2	קו תאים מונוציטים/לימפומה היסטיוציטית
THP-1	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	TIB-202	קו תאים מונוציטים/לוקמיה מונוציטית חריפה
MCF-10A	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	CRL-10317	קו תאי שד שלא עבר טרנספורמציה
MCF-7	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	HTB-22	קו תאי סרטן השד
מד"א-MB-231	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי ATCC	HTB-26	קו תאי סרטן השד
סל"ד 1640 בינוני	GIBCO BRL Life Technologies	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	11039-021
אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית	GIBCO BRL Life Technologies	15240-062	100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל פטריות
סרום בקר עוברי	GIBCO BRL Life Technologies	16000-044
נסיוב סוסים	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0.05% טריפסין-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	25300-062
PBS 1X (מלח חוצץ פוספט	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)	פפרוטק	AF-100-15 (1.00 מ"ג)
אינסולין	סיגמה-אולדריץ'	I1882-100 מ"ג
הידרוקורטיזון	סיגמה-אולדריץ'	H088-5G
רעלן כולרה Vibrio cholerae	סיגמה-אולדריץ'	C8052-1MG
מטריג'ל	קורנינג בע"מ	356237	סרקומה של עכבר Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), תמצית מטריצה חוץ-תאית, יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש בטמפרטורה של 4°C
שקופית Lab-Tek עם כיסוי (8 בארות)	Nalge Nunc הבינלאומי	177402