zPDX-אנליזה של פולשניות: חקירת התנהגות פולשנית של תאי סרטן גרורתיים בעוברי זברה Xenografts

1. תמונה וניתוח התהליך הגרורתי

1. אספו מספר עוברים מורדמים בעזרת פיפטה רחבת פסטר והעבירו אותם לתחתית הזכוכית של צלחת פוליסטירן.
2. יש להסיר עודפי מים ולשמור כמות מוגבלת של מי ביצה. יש לתמרן את העובר למקומו בעזרת כלי לולאת שיער ולהניח כיסוי על גבי הכוס.
3. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך בשילוב עם טבילה במים או מטרות יבשות למרחקים ארוכים. מקם את העובר כך שאזור העניין יהיה קרוב ככל האפשר למטרה.
4. בצע הדמיה מיד לאחר ההרדמה כדי להפחית את הסיכון למוות עקב אידוי נוזלים.
   1. לכוד אותות מכלי דם המסומנים ב- EGFP ותאי גידול המסומנים ב- mCherry באותו מיקום על העוברים כדי לרשום במשותף תאים מוזרקים עם כלי דם על ידי מיזוג שני ערוצי ההדמיה.
   2. עבור כל עובר של דג זברה, אספו שתי קבוצות שונות של תמונות מאזור הראש ואזור הזנב.
5. כמת את מספר התאים המופצים.
   1. עבור זריקות חלל perivitelline, לספור את מספר התאים בכל דג שהתפשטו ממסת התא לכיוון גוף הדג העוברי בתוך אזורי הראש והזנב 4,15; האזורים נמצאים מעבר לגבולות חלל הלב חזיתית, על גבי שלפוחית השחייה בגב, ומעבר לפתח האורגניטל באופן קאודלי.
   2. עבור הזרקת דוק, יש לספור את מספר התאים הבודדים שפלשו לסיבי הקולגן של סנפיר הזנב ממחזור הדם (MDA-MB-231) או את מספר הצבירים שנוצרו על ידי תאים באופן קולקטיבי (M2) ברקמה ההמטופויטית הקאודלית (CHT) של כל דג זברה19.
6. חקר פלישה וגרורות בפירוט רב יותר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (מומלץ מאוד).
   1. השתמש בהגדלה נמוכה (4X אובייקטיבית) כדי לדמות את כל הגוף ולקבל סקירה כללית של דפוס הפצת תאי הגידול.
      הערה: הגדלה גבוהה יותר (מטרות של 20X ו-40X) מתאימה לחקר אנגיוגנזה תוך-גידולית ופרי-גידולית וללוקליזציה מדויקת של תאים מפוזרים בגוף העובר.
   2. השתמש בלייזר של 488 ננומטר כדי לסרוק את כלי הדם של עובר דג הזברה ובלייזר של 543 ננומטר כדי לסרוק תאי גידול מושתלים המסומנים בפלואורסצנטיות אדומה. קבל תמונה באיכות גבוהה על ידי סריקת כל עובר בשמונה עד עשרה שלבים. סרוק ובצע ממוצע של כל שלב שש פעמים.
7. הניחו בזהירות את העובר בחזרה למי הביצית אם הוא נדרש לניסויים נוספים.