$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. דה-סלולריזציה
הערה: הליך זה הותאם משיטות שפורסמו בעבר והתמקדו בדה-צלולריזציה של שומן, שכללו את חומר הניקוי היוני נתרן דאוקסיכולאט במקום נתרן דודציל סולפט כדי להסיר DNA ביעילות.
- ביום הראשון, יש להסיר רפידות שומן חלב קפואות או MFP מ-80°C - ולהפשיר בטמפרטורת החדר.
- לאחר ההפשרה, יבשו את המדפסות הרב-תכליתיות לזמן קצר על מגבון משימה עדין. שקול את המדפסות המשולבות באמצעות קנה מידה אנליטי.
- בעזרת זוג מלקחיים עם מספריים או אזמל, מחלקים את הרקמה לדגימות של 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ לחקר ה- ECM השלם והרקמה הנותרת לייצור הידרוג'ל.
הערה: מספר הדגימות תלוי במספר שיטות הבדיקה, למשל איסוף שתי דגימות מתואר להלן: אחת להטמעת פרפין (שלב 1.5) ואחת להקפאה במדיום הטבעה קריוסטטי, במידת הצורך (ראה טבלת חומרים ושלב 1.6).
- שוקלים את הרקמות. אם הטבעה בפרפין לחלוקה למקטעים, המשך לשלב 1.5. אם הקפאה במדיום הטבעה קריוסטט לחתך, המשך לשלב 1.6.
- במכסה מנוע כימי, יש לטבול את הרקמה ב-10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF) (ראה טבלת חומרים) למשך 24 שעות ב-4°C. יש לשטוף 3 פעמים ב-PBS במשך 5 דקות כל אחת. לטבול את הרקמה ב 30% סוכרוז במשך 48 שעות ב 4 ° C.
- שקלו את הרקמה כעת, לאחר שפיסה זו הוסרה. המשך לשלב 1.6.
- במכסה מנוע כימי, הניחו חתיכות MFP בקלטת מסומנת שהוכנה עם מדיום הטבעה בהקפאה. הוסף עוד מדיום הטבעה קריוסטט כדי לכסות את הרקמה.
- הכניסו את הקלטת לכוס של 2-מתילבוטאן (ראו טבלת חומרים) שמקוררת מראש בחנקן נוזלי. הכוס צריכה להכיל מספיק 2-מתילבוטאן כדי לכסות את התחתית, אך לא מספיק כדי לטבול את הקלטת, מכיוון שמדיום ההטבעה של קריוסטט לא אמור לגעת ב-2-מתילבוטאן. מניחים לקלטת לשבת בתוך 2-מתילבוטאן עד שמדיום ההטבעה הקריוסטטי קופא והופך אטום.
- עטפו את הקלטת(ות) בנייר כסף, תייגו והשאירו בטמפרטורה של -80°C עד שתשמש לחתך.
הערה: רקמות שהונחו מיד בתווך הטבעה בהקפאה נחתכו ב-5 מיקרומטר ואילו רקמות שהודגרו בסוכרוז נחתכו ב-30 מיקרומטר כדי לשמור על מורפולוגיה של אדיפוציטים.
- השתמש במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה הנותרת.
הערה: ניתן גם להניח חתיכות רקמה ב-10% NBF למשך 24-48 שעות, לשטוף אותן ב-PBS ולהשאיר אותן באתנול 70% עד להטמעתן בפרפין. לאחר ההטבעה, ניתן להשתמש בחתכים של 5 מיקרומטר עבור צביעת המטוקסילין ואאוזין (H & E) (ראה סעיף 2 להלן).
- הכניסו את המדפסות הרב-תכליתיות לצלחות בקוטר 6 ס"מ עם תמיסת 5 מ"ל 0.02% טריפסין/0.05% EDTA. לדגור ב 37 ° C במשך 1 שעות. רססו ונגבו את הכלים באתנול 70% לפני הכנסתם לאינקובטור.
- השתמש במסננות בקוטר 0.7 מ"מ כדי לשטוף את המדפסות הרב-תכליתיות במים שעברו דה-יוניזציה (DI) על-ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמשו במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול. הניחו את הרקמות בתוך טרום אוטוקלאבית המכילה מוט ערבוב בגודל מתאים. יש לכסות רקמות ב-60 מ"ל של 3% t-אוקטילפנוקסיפוליאתוקסיאתנול (ראו טבלת חומרים) לכל גרם אחד של רקמה ולערבב במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל.
- יש לזרוק את הרקמה והתכולה למסננת. שוטפים את הכד במי DI ויוצקים על רקמות. חזור על הפעולה פעמיים נוספות. השתמשו במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול. מניחים את הרקמות ומערבבים בחזרה באותן כוסות, ומכסים ב-60 מ"ל של 4% חומצה דאוקסיקולית לכל גרם אחד של רקמה. יש לערבב במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל.
- יש לזרוק את הרקמה והתכולה למסננת רשת. שוטפים את הכד במי DI ויוצקים על רקמות. חזור על הפעולה פעמיים נוספות. השתמשו במלקחיים כדי לעסות ידנית את הרקמה בין השטיפות.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול.
- הניחו רקמות באותו עם מי DI טריים בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין. מכסים היטב בסרט פרפין. להשאיר ללילה ב 4 °C (75 °F).
- יש לשטוף מסננות וכוסות לשימוש למחרת.
- ביום השני, יש לנקז את תכולת הכוס למסננת. רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול.
- הניחו את המדפסות הרב-תכליתיות באותו עם מוט ערבוב בגודל מתאים. יש לכסות ב-60 מ"ל 4% אתנול/0.1% תמיסת חומצה פראצטית לכל 1 גרם רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
- יש לזרוק רקמות ותכולתן למסננת בקוטר 0.7 מ"מ. השתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. החזירו את התכולה לכד. לשטוף רקמות על ידי כיסוי אותו עם 60 מ"ל של 1x PBS לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה פעם אחת.
- יש לזרוק רקמות ותכולתן למסננת בקוטר 0.7 מ"מ. השתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. החזירו את התכולה לכוסית. לשטוף רקמות על ידי כיסוי אותו עם 60 מ"ל מים DI לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה פעם אחת.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול. יש לזרוק את הרקמה והתכולה למסננת. השתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני.
- החזירו את התכולה לכוסית. לכסות רקמות עם 60 מ"ל של 100% n-propanol לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. יש לערבב במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול. יש לזרוק רקמות ותכולתן למסננת בקוטר 0.7 מ"מ. השתמש במלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני.
- החזירו את התכולה לכוסית. לשטוף רקמות על ידי כיסוי אותו עם 60 מ"ל של מים DI לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
- יש לזרוק את הרקמה והתכולה למסננת. חזור על שלבים 2.3-2.6 כדי לאסוף פיסות רקמה לדגירת סוכרוז והקפאה בתווך הטבעה קריוסטטי.
- רקמה יבשה קצרה במשימה עדינה, לנגב ולשקול. מניחים בצינור מסומן 15 מ"ל. יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.