כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. טיפול בבלומיצין
- תכננו להזריק לעכברים בלומיצין תוך טרכאלי 14 יום לפני קליטת תאי הגידול.
- הפשירו מלאי בלומיצין על קרח שעתיים לפני ההזרקה.
- לאחר ההפשרה, יש לדלל את הבלומיצין לריכוז העבודה הרצוי (0.02 U/50 μL או 0.005 U/50 μL), ולשמור אותו על קרח.
הערה: ריכוז הבלומיצין תלוי בזן העכבר ששימש לניסויים (טבלה 1). טיטרציה של בלומיצין בעכברים צריכה להתבצע כדי לקבוע מינון אופטימלי.
- הכן את חומר ההרדמה על ידי דילול קטמין וקסילזין לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל ו-1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה, באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27 גרם, מרדים כל עכבר על ידי הזרקת תמיסת קטמין/קסילזין תוך צפקית במינון 100/10 מ"ג/ק"ג בהתאמה.
- עקוב אחר נשימתם של עכברים והשתמש בצביטת בוהן. ודא הרדמה נאותה כאשר העכבר אינו מגיב לצביטה בבוהן. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- הניחו עכבר אחד בכל פעם על משטח אינטובציה על ידי תליית שיניו הקדמיות עם גבו כנגד הרציף.
- האר את החזה העליון באמצעות מאיר סיב אופטי כדי לסייע בהדמיה של קנה הנשימה. פתח את פי העכבר ומשוך את הלשון החוצה בעדינות בעזרת מלקחיים שטוחים סטריליים.
- השתמש קטטר תוך ורידי ללא המחט כדי למנוע חסימת נשימה. מקמו את הצנתר מעל האור הלבן הנפלט מפתח קנה הנשימה.
- מחדירים את הצנתר לקנה הנשימה עד שהחלק העליון של הצנתר מגיע לשיניים הקדמיות. ודא מיקום תקין של הצנתר בקנה הנשימה על ידי הדמיה של האור הלבן הזוהר דרך פתח הצנתר בפה.
- באמצעות פיפטה, יש לפזר 50 μL של בלומיצין או רכב (PBS) ישירות לתוך הצנתר כדי להבטיח שכל הנפח נשאף. בצע שלב זה בתנאים סטריליים.
- אם הצנתר מוכנס כראוי, העכבר ישאף מיד את תוכן הצנתר. המתן מספר שניות עד שכל עוצמת הקול תעבור במורד הצנתר. לאחר מכן הסר את הצנתר מקנה הנשימה והשלך בתמיסת אקונומיקה 10%.
הערה: הזמן הממוצע לעכבר של שלבים 1.7-1.11 הוא כ- 5 דקות.
- אם העכבר אינו שואף את הנוזל, יש לעקוב בזהירות אחר הנשימה ולהתאים את מיקום הצנתר. אם העכבר מפסיק לנשום, הסר את הצנתר מיד ואפשר לעכבר לחזור לנשום כרגיל לפני החדרתו מחדש של הצנתר.
- הניחו את העכבר המוזרק על כרית חימום מאושרת IACUC על גבם על משטח שטוח להתאוששות. ההליך כולו ייקח 10 דקות לכל עכבר. אין להחזיר בעל חיים שעבר הזרקה לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
- הניחו כרטיס "כימיקל מסוכן בשימוש" על הכלוב למשך 24 שעות.
2. השתלת קווי תאי אדנוקרצינומה ריאתיים
הערה: בצע השתלה של תאים 14 יום לאחר הזרקת בלומיצין (שלב 1.1)
- לאפשר לתאים לגדול ב 75 ס"מ2 צלוחיות ללא הפרעה במשך 3 ימים לפני יום ההזרקה עם מדיה מתאימה כאמור בשלב 1.3.
הערה: הם צריכים להיות 80% confluent ביום ההזרקה (אשר מתאים 2-3 x 106 בכל בקבוק בהתאם לקו התא).
- לשטוף את התאים הגדלים על 75 ס"מ2 צלוחיות עם 5 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר.
- שאפו PBS והוסיפו 1.5 מ"ל טריפסין לתאים ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים יתנתקו (בדרך כלל 2-5 דקות).
הערה: אנו ממליצים לבדוק כל 2 דקות ניתוק תאים מהפלסטיק על ידי הדמיה פשוטה של תחתית הבקבוק או תחת מיקרוסקופ אור. אין לחרוג מ-5 דקות דגירה עם טריפסין.
- נטרול טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של מדיה המכילה 10% FBS (אותה מדיה כמו שלב 2.1). אספו את התאים לתוך צינור של 15 מ"ל וצנטריפוגו אותו במהירות של 200 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את המדיה והשעו מחדש את גלולת התא ב -5 מ"ל של PBS כדי לשטוף תאים. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר לתאי כדור. חזור על פעולה זו פעם אחת.
- שאפו את PBS והשעו מחדש את הגלולה ב -1.5 מ"ל PBS לכל בקבוק.
- ערבבו 50 μL של תערובת תאים עם 50 μL של טריפאן כחול וספרו את התאים באמצעות תא מונה תאים/המוציטומטר.
- הכן את תרחיף התאים על ידי דילול התאים ב- PBS כדי להזריק 1 x 105 תאים (או כמות אחרת שצוינה) ב- 50 μL לעכבר. שמור את התאים על קרח לפני ההזרקה.
הערה: הכינו לפחות פי שניים יותר תאים להזרקה כדי למנוע את השעיית התא.
- הכן את ההרדמה על ידי דילול קטמין וקסילזין לריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל ו 1 מ"ג / מ"ל, בהתאמה, באמצעות מזרק 1 מ"ל ומחט 27 גרם, להרדים כל עכבר על ידי הזרקת תמיסת קטמין/קסילזין תוך צפקית ב 100/10 מ"ג / ק"ג בהתאמה.
- עקוב אחר נשימתם של עכברים והשתמש בצביטת בוהן. ודא הרדמה נאותה כאשר העכבר אינו מגיב לצביטה בבוהן. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- הניחו עכבר אחד בכל פעם על משטח אינטובציה על ידי תליית שיניו הקדמיות עם גבו כנגד הרציף.
- האר את החזה העליון באמצעות מאיר סיב אופטי כדי לסייע בהדמיה של קנה הנשימה.
- השהה מחדש את התאים בעדינות באמצעות פיפטה p200 כדי לוודא שהם אינם יוצרים גושים. פתח את פי העכבר ומשוך את הלשון החוצה בעדינות בעזרת מלקחיים שטוחים סטריליים.
- השתמש קטטר תוך ורידי עם המחט הוסרה כדי למנוע חסימת נשימה. מקמו את הצנתר מעל האור הלבן הנפלט מפתח קנה הנשימה.
- מחדירים את הצנתר לקנה הנשימה עד שהחלק העליון של הצנתר מגיע לשיניים הקדמיות. ודא מיקום תקין של הצנתר בקנה הנשימה על ידי הדמיה של האור הלבן הזוהר דרך פתח הצנתר בפה.
- באמצעות פיפטה, לפזר 50 μL של תאים ישירות לתוך הצנתר כדי להבטיח כי נפח כולו נשאף. בצע שלב זה בתנאים סטריליים.
הערה: אם הצנתר מוכנס כראוי, העכבר ישאף מיד את תוכן הצנתר.
- יש להמתין מספר שניות עד שכל הנפח עובר במורד הצנתר, ולאחר מכן להוציא את הצנתר מקנה הנשימה ולהשליך פנימה תמיסת אקונומיקה 10%.
- אם העכבר אינו שואף את הנוזל, עקוב בזהירות אחר הנשימה והתאם את מיקום הצנתר. אם העכבר מפסיק לנשום, הסר את הצנתר מיד ואפשר לעכבר לחזור לנשום כרגיל לפני החדרתו מחדש של הצנתר.
הערה: הזמן הממוצע לעכבר בשלבים 2.11-2.18 הוא כ-5 דקות.
- הניחו את העכבר המוזרק על כרית חימום מאושרת IACUC על גבם על משטח שטוח להתאוששות.
הערה: ההליך כולו ייקח 10 דקות לכל עכבר. אין להחזיר בעל חיים שעבר הזרקה לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
- יש לגלח את כל אזור הצלעות הן בגחון והן בגב, של זני B6129SF1/J וזני עכברים אחרים בעלי שיער כהה באמצעות מכונת גילוח חשמלית לפני ההדמיה.
- 2-3 דקות לאחר הזרקת התא, יש להזריק 100 מיקרוליטר של לוציפרין רטרו-אורביטלי (15 מ"ג/מ"ל) באמצעות מחט אינסולין. החליפו את העין המשמשת להזרקה בכל מפגש הדמיה.
- לאחר 2 דקות לפחות, מקם עד 5 עכברים בהדמיה ביולומינסנציה של בעלי חיים במצב השכיבה הגבית וקבל תמונה גחונית באמצעות הגדרות זוהר.
- בלוח הבקרה התאם את הגדרות הרזולוציה והרגישות כדי למדוד את עוצמת האור של קו תא נתון. עבור רוב היישומים, התחל ב- 3 דקות (או "אוטומטי" אם רווי), binning=בינוני (4), F/Stop=1, שדה ראייה=D, גובה נושא=1.50.
הערה: אם ההזרקה מצליחה, אות זוהר מזוהה באזור החזה העליון, בריאה אחת או בשתי הריאות.
- הופכים עכברים לתנוחת שכיבה עצם החזה ומקבלים תמונה גבית כנ"ל.
הערה: אם הזרקת התאים אינה מבוצעת כראוי, תאים עלולים להתקבץ בכניסה לקנה הנשימה או בצוואר.
- הזריקו קטופרופן 5 מ"ג/ק"ג תוך צפקית כדי להקל על הכאב.
- החזירו עכברים לכלוב שלהם והניחו כרטיס "סוכן BSL-2 בשימוש" על הכלוב.
- יש לעקוב אחר מצוקה נשימתית בעכברים מיד לאחר האינטובציה, ולאחר מכן כל 15 דקות עד שהעכברים מתעוררים מההרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
- בדקו את העכברים 24 שעות לאחר האינטובציה ושלוש פעמים בשבוע לאיתור סימני תחלואה.
- שמור תיעוד ביומן של תאריך ההליך, זיהוי בעלי חיים, סוג ההליך, סוג ההרדמה ומעקב לאחר הניתוח תצפיות וזמנים.
- מעקב אחר עכברים לירידה במשקל, מצוקה נשימתית, הפרעות התנהגותיות וציון מצב גוף <2 (פילוח עמוד השדרה ניכר/עצמות אגן גבי מוחשיות) דו-שבועי לאחר חיסון בלומיצין.
הערה: עכברים עם גידולי ריאות עלולים להציג גירוי נשימתי, ירידה במשקל, cachexia, ו / או מוות.
- המתת חסד עכברים במצוקה נשימתית או עכברים שחוו אובדן של 15% ממסת הגוף על ידי פחמן דו חמצני או על ידי קטמין/קסילזין ולאחר מכן נקע צוואר הרחם אם הם אוספים רקמות. לאשר המתת חסד על ידי ביצוע מישוש לפעילות נשימתית.
3. ניטור צמיחת הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציה
- יש לחזור על ההדמיה של העכברים ביום השלישי שלאחר ההשתלה ומדי שבוע לאחר מכן.
- מרדימים עכברים על ידי הזרקת קטמין/קסילזין (כמתואר בשלבים 2.4-2.5) או על ידי איזופלורן בשאיפה (2%). עקוב אחר נשימת עכברים והשתמש בצביטת בוהן כדי לוודא הרדמה נכונה. יש למרוח משחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
- יש לגלח את כל אזור הצלעות הן בגחון והן בגב, של B6129SF1/J וזני עכברים אחרים בעלי שיער כהה באמצעות מכונת גילוח חשמלית לפני ההדמיה.
- ברגע שהעכברים נמצאים תחת הרדמה, הזריקו 100 μL של לוציפרין רטרו-אורביטלי (15 מ"ג/מ"ל) באמצעות מחט אינסולין. המתינו 2 דקות. החליפו את העין המשמשת להזרקה בכל מפגש הדמיה.
- מקם עכברים במכונת ההדמיה וקבל תמונות גביות וגחונות כמתואר בשלבים 2.22-2.24.
- החזירו עכברים לכלוב לאחר ההדמיה, על גבם על משטח שטוח להתאוששות.
הערה: ההליך כולו ייקח 5 דקות לכל קבוצה של 5 עכברים. אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה.
- נתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח imager/bioluminescence.
