$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הקמת שלושה קווי תאים עצמאיים עמידים בפני אפטיניב PC-9
- קביעת ריכוז החשיפה הראשוני לאפאטיניב עבור תאי PC-9 באמצעות בדיקת 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT).
- תרבית תאי PC-9 במדיום גדילה המכיל נסיוב בקר עוברי (10%), פניצילין (100 U/mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) בתרבית תאים שטופלה בצלחת של 10 ס"מ באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C.
- השהה מחדש תאי PC-9 ב 4 x 104 תאים / מ"ל במדיום צמיחה ולאחר מכן זרע ב 50 μL / באר במיקרו צלחת 96 באר. הריכוז הסופי של התאים הוא 2.0 x 103 תאים / 50 μL / באר. יש לדגור למשך הלילה באינקובטור של 5%CO2 בטמפרטורה של 37°C.
- הוסף 50 μL של תמיסת אפטיניב בריכוזים שונים: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6 ו- 20 מיקרומטר לבארות המכילות את מצע הגידול (50 μL). הנפח הסופי והריכוזים של אפטיניב הם 100 μL ו- 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 ו- 10 מיקרומטר, בהתאמה.
- לדגור על צלחת 96 בארות במשך 96 שעות באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C.
- הוסף 15 μL של תמיסת הצבע (ראה טבלת חומרים) לכל באר ודגר במשך 4 שעות באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C, ולאחר מכן הוסף 100 μL של מסיסות/תמיסת עצירה (ראה טבלת חומרים) לכל באר ודגר לילה באינקובטור 5% CO2 ב 37 ° C.
- מדוד את הצפיפות האופטית ב- 570 ננומטר (OD570) באמצעות קורא מיקרו-לוחות (ראה טבלת חומרים). הכינו 6-12 עותקים משוכפלים וחזרו על הניסויים לפחות שלוש פעמים.
- השתמש בתוכנה סטטיסטית (ראה טבלת חומרים) כדי להתוות נתונים אלה באופן גרפי כגרף יומן למחצה ולחשב את ערך IC50, שהוא ריכוז התרופה המפחית את התגובה ל -50% מהמקסימום שלה (ראה טבלת חומרים).
- חשיפה מתמשכת של תאי PC-9 ל- EGFR-TKI הבלתי הפיך, אפאטיניב, על ידי עליית מינון הדרגתית בשלוש צלחות עצמאיות של 10 ס"מ
- תרבית תאי PC-9 בצלחות p100 המכילות 10 מ"ל של מדיום גידול. כאשר תאי PC-9 מגיעים לשלב התת-קונפלואנטי, מעבירים 1 מ"ל של תרחיף תאים לשלוש צלחות p100 חדשות, עם 9 מ"ל של מדיום גידול. תאי PC-9 מדוללים ביחס של 1:10 הופכים לתת-נפגשים תוך 3-4 ימים, עם מספר תאים של כ-4-5 x 105 תאים/מ"ל.
- למחרת, הוסף 1/10 מערך IC50 של afatinib לכל אחת משלוש מנות p100.
הערה: Afatinib מורכב מחדש DMSO בריכוזי מלאי של 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM, ו 5 mM. 1 עד 10 מיקרוליטר של תמיסת אפטיניב מתווסף ל -10 מ"ל של מדיום גידול בתרבית, בהתאם לריכוזים הסופיים הנדרשים.
- כאשר התאים בצלחות p100 המכילות אפטיניב הופכים לתת-חופפים, מערבבים היטב על ידי שאיפה עם פיפטה של 1 מ"ל ומוסיפים 1 מ"ל של תרחיף התא ל -9 מ"ל של מדיום גידול טרי בצלחת p100 חדשה. לאחר מכן, הוסיפו ריכוזים גבוהים ב-10-20% של אפטיניב לתרבות החדשה.
- הגדל את ריכוז האפאטיניב של 0.1 ננומטר ל -1 מיקרומטר בתווך על ידי עליית מינון הדרגתית עם ריכוז אפטיניב גדל ב 10-20% בכל שלב על פני תקופה של 10-12 חודשים.
הערה: כאשר ריכוז האפאטיניב מתקרב לערך IC50, צמיחת התאים הופכת איטית למדי. אם התאים מפוצלים ביחס של 1:9, הם עלולים שלא לגדול, מכיוון שתאים אלה נהרגים על ידי ריכוזים גבוהים יותר של אפטיניב (afatinib). לכן, בריכוזי אפאניטיב גבוהים יותר, ניתן לפצל את התאים ביחס של 1:2. התאים העמידים ביותר גודלו בתווך המכיל אפטיניב במשך 3-14 ימים, והמדיום לא השתנה עד שהיה צורך לעבור את התאים העמידים.
- תרבית את התאים העמידים לאפטיניב במשך 2-3 חודשים במצע גידול המכיל אפטיניב 1 מיקרומטר. בריכוז אפטיניב של 1 מיקרומטר, נדרשים 10-12 חודשים לפיתוח עמידות לאפאטיניב במודל זה. בצע את בדיקת MTT כדי לאשר כי התאים עמידים afatinib. שלושת קווי תאי ההתנגדות לאפטיניב שהוקמו באופן עצמאי נקראו AFR1, AFR2 ו-AFR3.