הכנת דגימות גידול משובצות פרפין קבועות פורמלין: פרוטוקול לשימור דגימות רקמות וציטולוגיה מסרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC)

תקציר

מקור: Ilié, M., et al. שימוש בנוגדנים 22C3 נגד PD-L1 מתרכז בדגימות ביופסיה וציטולוגיה מחולי סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים.J. Vis. Exp. (2018).

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות גידול משובצות פרפין קבועות פורמלין המשמשות לשימור דגימות רקמות וציטולוגיה מסרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC)

פרוטוקול

1. הכנת דגימות רקמת גידול

1. תקן רקמת גידול בפורמלין חוצץ ניטרלי 10% (NBF) בקלטת.
   הערה: רקמת הגידול מגידולי ריאה פרוקסימליים מתקבלת בדרך כלל על ידי ברונכוסקופיה, המבוצעת תחת הרגעה מתונה על ידי פולמונולוג, או מומחה ריאות. עבור נגעים היקפיים ומחלת ריאות מפושטת, ביופסיה transbronchial או מחט מצוין. הליכים אלה נעשים בדרך כלל בחדר ניתוח או ביחידה לטיפול נמרץ.
2. הטמע את הקלטת בפרפין.
   הערה: קיבוע יכול להיות מושג על ידי זילוח או טבילה מיד לאחר נתיחה, ובדרך כלל דורש 8-10 שעות. נפח הקיבוע צריך להיות גבוה פי 15–20 מנפח הדגימה. לא מומלץ לתקן רקמת ביופסיה במשך יותר מ -10 שעות, כי קיבוע יתר יכול לגרום מיסוך של האנטיגן. מהירות הקיבוע היא כ-1 מ"מ/שעה בטמפרטורת החדר.
3. להחדיר את דגימת הרקמה הקבועה עם שעווה במעבד הרקמה (ראה רשימת חומרים).
   הערה: התייבשות מבוצעת בשלוש אמבטיות אלכוהול עם ריכוזים הולכים וגדלים 70%, 85% ו -90%. המים מוסרים לבסוף על ידי שלוש אמבטיות אלכוהול מוחלטות אחרונות. הניקוי מתבצע בשלוש אמבטיות טולואן, וחדירת השעווה באמבטיות שעווה חמות (44-60 מעלות צלזיוס).
4. מטמיעים את הרקמה בתוך תבנית מלאה בפרפין מותך (ראו טבלת חומרים) ומחכים להתמצקות.
5. חותכים את הרקמה המשובצת בפרפין בעובי של 3 מיקרומטר על מיקרוטום.
6. העבירו את סרט הפרפין לשקופית זכוכית במיקרוסקופ טעון חיובית (ראו טבלת חומרים).
7. יבש את המגלשה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: יש לאחסן את חלקי הרקמה בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס (מועדפת) או בטמפרטורת החדר עד 25 מעלות צלזיוס כדי לשמור על אנטיגניות, ולהכתים בתוך 15 ד' מרגע החיתוך.

2. הכנת דגימות ציטולוגיה

1. יש לאסוף שטיפות סימפונות בתמיסה משמרת (ראו טבלת חומרים).
   הערה: לשם כך, טכניקה ברונכוסקופיה סטנדרטית משמש.
   1. לשטוף את התפלגות הסימפונות לדגימה. אספו את הכביסה בכלי נקי. תייג את המכל עם השם הפרטי ושם המשפחה של המטופל, תאריך הלידה ומקור הדגימה.
2. מעבירים את שטיפות הסימפונות לצינור חרוטי של 50 מ"ל ומוסיפים 2 גרם אבקת DL-Dithiothreitol (ראו טבלת חומרים), מערבלים את הצינור למשך 30 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגות אותו ב 250 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של תמיסה mucolytic (ראה טבלה של חומר).
4. נערו את הדגימה במשך 20 דקות במהירות בינונית (רמה 9) וצנטריפוגו אותה במהירות של 250 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הסר את supernatant והפקיד את גלולת התא בצינורות איסוף המכילים 10% NBF.
6. הוסף 4 טיפות של מגיב הכנת בלוק התא (ראה טבלת חומרים) לגלולת התא.
7. העבירו את כדורית התא לקלטת, תקנו אותה ב-10% NBF והטמיעו אותה בפרפין לצורך הכנה וחלוקה של בלוקים (ראו שלבים 1.1–1.7).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NovaPrep HQ1	נובציטים	נה	תמיסה משמרת עבור דגימות ציטולוגיה
Novaprep® HQ+ B	נובציטים	נה	תמיסה מוקוליטית
טיש-טק VIP 6	סאקורה	6042 VIP 6
Tissue-Tek TEC 5 Tissue הטמעת מערכת קונסולה	סאקורה	5229 TEC 5
זכוכית מיקרוסקופ שקופיות סופרפרוסט פלוס	תרמו פישר סיינטיפיק	4951PLUS4
אבקת DL-Dithiothreitol	סיגמא-אולדריץ'	D3801
Heidolph Multi Reax Vortex Shaker	תרמו פישר סיינטיפיק	13-889-410
Shandon Cytoblock	תרמו פישר סיינטיפיק	7401150