בדיקת היווצרות מושבה: הערכת היעילות של חומרים אנטי-סרטניים על תאי סרטן ריאה יוצרי מושבה

תקציר

מקור: Lee, J. Y.et al, הערכה פרה-קלינית של הפעילות הביולוגית של Coumarin OT48 האנטי-סרטני על ידי ספרואידים, בדיקות היווצרות מושבה וקסנוגרפטים של דגי זברה.J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את בדיקת היווצרות המושבה, המסייעת לקבוע את יכולתם של תאי סרטן הריאה להתרבות ללא הגבלת זמן וליצור מושבות בודדות. אנו יכולים לנתח את ההשפעה של סוכן אנטי-סרטני על התאים יוצרי המושבה על ידי ניתוח השינויים במספר ו / או בגודל של המושבות המתקבלות.

פרוטוקול

1. מבחני היווצרות מושבות

1. תרבית תאי A549 בריכוז של 20,000 תאים לסמ"ק² ב-15 מ"ל של מדיום תרבית תאים RPMI1640 בתוספת 10% FBS (סרום בקר עוברי) ואנטיביוטיקה 1% בבקבוק² בגודל 75 ס"מ באינקובטור CO₂ בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂.
2. ביום הניסוי, לקבוע את ריכוז התא באמצעות המוציטומטר. לאסוף 50,000 תאים באמצעות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 7 דקות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ולהשהות מחדש תאים ב 100 μL של 1x סטרילי PBS (פוספט חוצץ מלח) בצינורות 1.5 מ"ל.
3. יש להוציא 1.1 מ"ל של מדיום מוצק למחצה מבוסס מתילצלולוז (MCBM) בצינורות של 15 מ"ל עם מולטיפיפטה. הכינו צינור אחד לכל מצב.
4. הוסף 110 μL של FBS ל- 1.1 מ"ל של MCBM באמצעות מיקרופיפטה P200.
5. זרעים של תאים ב-1,000 תאים/מ"ל. אספו 2.4 מיקרוליטר של תרחיף תאים מתמיסת המלאי (50,000 תאים ב-100 מיקרוליטר של 1x PBS) באמצעות מיקרופיפטה P2 והוסיפו ל-1.1 מ"ל MCBM בתוספת 10% FBS.
6. לאחר הוספת התאים, מערבלים את הצינורות במשך דקה אחת, מחזיקים אותם אנכית במהירות הגבוהה ביותר כדי לערבב MCBM ותאים היטב.
7. הוסף תרכובות בדיקה (OT48 לבד או בשילוב עם A1210477). הכן צינור נפרד כבקרה עבור הממס המשמש (כאן dimethyl sulfoxide (DMSO)). בהתאם לריכוז התרכובות והנפח שנוסף לכל מצב, בקרת הממס תכלול את הריכוז הגבוה ביותר של ממס המשמש לדילול תרכובת הבדיקה, כדי להעריך את ההשפעות השליליות הנגרמות על ידי הממס.
8. מערבולת צינורות במשך 1 דקה.
9. עבור כל בדיקה, להוסיף 1 מ"ל של תערובת עם מיקרופיפטה P1000 למרכז הבאר של צלחת תרבית תאים 12 בארות.
10. מלא בארות ריקות עם 1 מ"ל של מים סטריליים או 1x PBS כדי לייצב את הלחות.
11. דגרו על צלחות תרבית במשך 10 ימים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂
12. לאחר 10 ימים של דגירה, הוסף 200 μL של תמיסת מלאי MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) (5 מ"ג / מ"ל) לכל באר כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל.
13. יש לדגור 10 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂. מושבות בנות קיימא יהפכו לסגולות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
A549	ATCC	CCL-185	37 מעלות צלזיוס
RPMI 1640	לונזה	30096	4 מעלות צלזיוס
פ.ב.ס.	ביוווסט	S1520-500	-20 מעלות צלזיוס
פניצילין-סטרפטומיצין	לונזה	17-602E	-20 מעלות צלזיוס
בקבוק תרבית תאים T75	SPL	70075	RT
פתרון PBS	היקלון	SH30256.02	RT
צינור 1.5 מ"ל	אקסטרגן	צינור-170-C	RT
צינור 15 מ"ל	יונדאי מיקרו	H20015	RT
12 צלחת באר	SPL	30012	RT
MethoCult	טכנולוגיות StemCell	4230	-20 מעלות צלזיוס
תיאזוליל בלו טטרזוליום ברומיד (אבקת MTT)	סיגמא	M5622	4 מעלות צלזיוס
LAS4000	GE טכנולוגיות בריאות		RT