Zebrafish Xenograft Assay: שיטה להערכת היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים על גידולים בדגי זברה in vivo

תקציר

מקור: Lee, J. Y et al., הערכה פרה-קלינית של הפעילות הביולוגית של Coumarin OT48 האנטי-סרטני על ידי ספרואידים, בדיקות היווצרות מושבה וקסנוגרפטים של דגי זברה.J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את בדיקת xenograft של דג הזברה כדי להעריך היווצרות גידול in vivo וללמוד את ההשפעה של חומרים טיפוליים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דג זברה בדיקת Xenograft

הערה: גישה טכנית זו מוצגת באופן חזותי כסכמטי (איור 1).

1. הכנת ריאגנטים מלאי
   1. הכינו 1 ליטר של 30x התמיסה של Danieau: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄•7H2O, 18 mM Ca(NO₃)₂ ו- 150 mM HEPES. כוונן ל- pH של המאגר ל- 7.6 באמצעות מד pH.
   2. הכנת תמיסת טריקאין 1% (50x): המסת 20 מ"ג אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (טריקאין) ב-2 מ"ל מים מזוקקים.
   3. הכן תמיסת 1% פנול Red-PBS: הוסף 2 μL של פנול תמיסת מלח נתרן אדום ל 198 μL של תמיסת PBS מעוקרת בצינור 1.5 μL.
   4. הכינו 3% מתילצלולוז: הוסיפו 3 גרם מתילצלולוז ל-100 מ"ל של תמיסה 1x Danieau.
2. ייצור ביצי זברה ודגירה
   1. הפרידו בין נקבה אחת לדגי זברה זכרים במיכל מחיצה מלא במי ברז מעוקרים ומסוננים UV בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר 24 שעות של הפרדה, ערבבו דגים משני המינים כדי להתחיל הזדווגות. מעבירים ביצים מופרות ממיכל ההזדווגות לצלוחית פטרי המכילה 5 מ"ל של תמיסה טרייה של דניאו.
   2. לשטוף ביצים שלוש פעמים עם 5 מ"ל של הפתרון של Danieau. לשטיפה, בזהירות לשאוף את הביצים עם פיפטה ולהעביר ל 5 מ"ל של פתרון טרי. לדגור במשך 8 שעות ב 28.5 ° C.
      1. לאחר 8 שעות של דגירה בתמיסה של Danieau, יש לעבור לתמיסה של Danieau המכילה 0.03% 1-phenyl-2-thiourea (PTU) כדי לעכב פיגמנטציה. מיין ביציות אטומות (לא מופרות או מכילות עוברים לא מפותחים) כדי למנוע זיהום.
3. דכוריונציה של עוברים
   1. 24 שעות לאחר ההפריה (HPF), עוברים של דגי זברה דכוריונטים באמצעות מלקחיים חדים. לדגור על עוברים בוקעים בתמיסה של Danieau עם 0.03% PTU ב 28.5 ° C עד 48 hpf.
4. הכנת תאים מטופלים מורכבים
   1. זרע A549 תאים ב 20,000 תאים / ס"מ² ב 25 ס"מ² צלוחיות תרבית. לאחר 24 שעות של זריעה, הוסף תרכובות (כאן OT48 ב 50 מיקרומטר ו / או A1210477 ב 20 מיקרומטר) במשך 24 שעות באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   2. הגדירו את זמן הטיפול עבור כל תרכובת כדי לשמור על יכולת הקיום של התאים אך לבצע אותם לקראת מוות תאי. נקודת זמן זו צריכה להיות מוגדרת בנפרד בהתבסס על כדאיות התא, מורפולוגיה וסמנים מולקולריים.
   3. 2 שעות לפני סיום הטיפול, לצבוע תאים עם 4 מיקרומטר של צבע מעקב תאים פלואורסצנטי CM-דיל ב 37 ° C ו 5% CO₂. לאחר שעתיים של דגירה, טריפסין תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, ומדלל 106 תאים ב 50 μL של פנול תמיסת Red-PBS לפני ההזרקה.
5. מיקרו-הזרקה של תאים סרטניים להיווצרות xenograft
   1. מרדימים דגי זברה בתמיסת טריקאין 0.02% למשך 5 דקות עד שהם מתיישבים על צלחת אגר.
   2. משוך נימי זכוכית בקוטר 1.0 מ"מ (OD) בקוטר חיצוני) באמצעות מושך מיקרופיפטה (הגדרות תוכנית: P: 300, חום: 260, משיכה: 60, VEL: 50 וזמן: 200). חותכים את microcapillary עם מזרק כדי לייצר קצה חד. טען מיקרו-נימים עם 20 μL של תמיסת תאים/פנול Red-PBS. הגדר לחץ הזרקה וזמן לחלוקת 2 nL לכל הזרקה.
   3. הזריקו 100-200 תאים לתוך שק החלמון על ידי הזרקת 6 עד 10 nL באמצעות 3 עד 5 זריקות. לאחר ההזרקה, יש לאפשר לדגים להתאושש במשך 10 עד 30 דקות ב-5 מ"ל של תמיסה טרייה של Danieau המכילה תמיסת PTU. שלח דגים בצלחות 24 בארות עם 1 מ"ל של תמיסה של Danieau המכיל תמיסת PTU הם לדגור במשך 72 שעות ב 28.5 ° C.
   4. לאחר 72 שעות של דגירה, מרדימים דגים בתמיסת טריקאין 0.02% ומשתקים על מגלשת זכוכית עם טיפה של 3% מתילצלולוז. צלם 5x תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי באורך גל של 620 עד 750 ננומטר.
   5. כמת את גודל הגידולים הפלואורסצנטיים באמצעות תוכנת ImageJ. בחר בתפריט "נתח | מידה". שמור ערכים המתאימים לאות הפלואורסצנטי ונתח באמצעות תוכנת סטטיסטיקה לייצוג גרפי.

תוצאות

איור 1: תרשים סכמטי של התהליך הכולל של בדיקת xenograft של דגי זברה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
A549	ATCC	CCL-185	37 מעלות צלזיוס
RPMI 1640	לונזה	30096	4 מעלות צלזיוס
פ.ב.ס.	ביוווסט	S1520-500	-20 מעלות צלזיוס
פניצילין-סטרפטומיצין	לונזה	17-602E	-20 מעלות צלזיוס
בקבוק תרבית תאים T25	SPL	70025	RT
בקבוק תרבית תאים T75	SPL	70075	RT
בקבוק תרבית תאים T175	SPL	71175	RT
צינור 1.5 מ"ל	אקסטרגן	צינור-170-C	RT
24 צלחת באר	SPL	30024	RT
פטרידיש	SPL	10100	RT
פתרון PBS	היקלון	SH30256.02	RT
טריפסין-EDTA	גיבקו	25-300-054	4 מעלות צלזיוס
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	71382	RT
אשלגן כלורי (KCL)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541	RT
מגנזיום סולפט הפטהידראט (MgSO4.7H2O)	סיגמא-אולדריץ'	M2773	RT
סידן חנקתי טטרהידראט (Ca(NO3)2)	סיגמא-אולדריץ'	C1396	RT
תמיסת HEPES	סיגמא-אולדריץ'	H0887	RT
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (טריקאין)	סיגמא-אולדריץ'	E10521	RT
תמיסת פנול אדום	סיגמא-אולדריץ'	P0290	RT
מתילצלולוז	סיגמא-אולדריץ'	M0512	RT
1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)	סיגמא-אולדריץ'	P7629	RT
צבע CM-דיל	Invitrogen	C7001	-20 מעלות צלזיוס
נימי זכוכית	מכשירים מדויקים בעולם	TW 100F-4	RT
מושך מיקרופיפטה	מכשיר תריס, ארה"ב	P-97	RT
מזרק מיקרו	מכשירים מדויקים בעולם	PV820	RT
מזרק	קובקס	1 מ"ל	RT
מטעין מיקרו	אפנדורף	5242956003	RT
שקופית זכוכית	מרינפלד	HSU-1000612	RT
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	לייקה	DE/DM 5000B	RT