בדיקת פוטוטוקסיות חוץ גופית: שיטה מבוססת PDT להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר בתאי סרטן ריאות

תקציר

מקור: Chang, J. E., et al. יעילות אנטי-סרטנית של טיפול פוטודינמי עם ננו-חלקיקים ממוקדי סרטן ריאות.J. Vis. Exp.(2016).

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא שיטה לא פולשנית ולא ניתוחית לטיפול בסרטן ריאות. פוטוסנסיטיזרים מצטברים באופן סלקטיבי ברקמת הגידול ומובילים למוות תאי הגידול בנוכחות חמצן ואורך גל תקין של אור. בסרטון פרוטוקול זה, שיטה מבוססת PDT משמשת להערכת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר פוטנציאלי בתאי סרטן ריאות.

פרוטוקול

1. סינתזה של חומצה היאלורונית-סרמיד (HACE)

1. מסיסים 12.21 mmol של חומצה היאלורונית (HA) oligomer ו-9.77 mmol של tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA) ב-60 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים (DDW). מערבבים במשך 30 דקות.
2. כדי לסנתז את המקשר DS-Y30, יש להמיס 8.59 mmol של DS-Y30 ceramide ו-9.45 mmol של triethylamine ב-25 מ"ל של tetrahydrofuran (THF). מערבבים עם 8.59 mmol של 4-chloromethylbenzoyl chloride ב-THF. יש לערבב במשך 6 שעות ב-60°C.
3. ממיסים את 8.10 mmol המסונתז של HA-TBA ו-0.41 mmol של DS-Y30 linker בתערובת של THF ואצטוניטריל (4:1, v/v). יש לערבב במשך 5 שעות ב-40°C.
4. הסר זיהומים על ידי סינון עם סוכן מסנן, ולחסל את הממס האורגני על ידי אידוי ואקום. לטהר את המוצר באמצעות קרום דיאליזה (חיתוך משקל מולקולרי: 3.5 kDa) ו lyophilize.

2. הכנת הננו-חלקיקים

1. יש להמיס 1 מ"ג HB ו-1 מ"ג פקליטקסל ב-0.5 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולערבב עם 0.5 מ"ל DDW על ידי ערבוב מערבולות במשך 5 דקות. לאחר מכן, יש להמיס HACE בתערובת זו על ידי ערבוב מערבולות למשך 5 דקות נוספות.
2. כדי לחסל את הממס, לחמם ב 70 ° C במשך 4 שעות תחת זרם עדין של גז חנקן.
3. השהה מחדש את הסרט המורכב מ- HACE, HB ופקליטקסל עם 1 מ"ל DDW. סנן עם מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.45 מיקרומטר) כדי להסיר תרופות ללא כמוסות.

3. פוטוטוקסיות חוץ גופית

1. ספיגה של ננו-חלקיקים בשורות תאים של סרטן ריאות
   1. הכינו RPMI-1640 סרום בקר עוברי בינוני המכיל 10% (v/v) ו-1% (w/v) פניצילין-סטרפטומיצין.
   2. זרע תאי A549 בצלחות תרבית תאים של 24 בארות בצפיפות של 1 × 10⁵ תאים לבאר (טריפליקטים לכל קבוצה). יש לדגור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37°C (75°F) באטמוספירה לחה של 5% CO₂ ו-95% אוויר.
   3. לאחר חיבור התא, הסר את המדיום ושטוף את התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
   4. ממיסים את הננו-חלקיקים ב-PBS לריכוז סופי של 2 מיקרומטר/מ"ל HB. לאחר מכן, לדגור על התאים עם 1 מ"ל של PBS, NPs ריקים, HB-NPs, או HB-P-NPs בכל באר במשך 4 שעות בחושך.
   5. הסר את כל התמיסה ושטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS קר. חזרו על שלב הכביסה פעם נוספת. הוסיפו מדיום תרבית רענן.
2. בדיקת כדאיות התא
   1. מניחים את צלחת תרבית התאים מתחת לסיב PDT (עם מרחק של 1 ס"מ מסיב ה-PDT לבאר). הרכיבו משקפי בטיחות בלייזר והאירו את התאים בלייזר PDT (630 ננומטר, 400 mW/cm²) בחושך לפרקי זמן שונים: 0, 5, 10, 20, 30 ו-40 שניות (0, 2, 4, 8, 12 ו-16 J/cm²). לאחר מכן, לדגור על התאים במשך 24 שעות בחושך.
   2. שואפים את המדיום ולשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS קר. חזרו על שלב הכביסה פעם נוספת.
   3. הוסף 10 μl של תמיסת מדידת ציטוטוקסיות לכל באר. לדגור בחושך במשך שעתיים.
   4. מדוד את הספיגה ב- 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה היאלורונית אוליגו	Bioland ושות', בע ' מ
DS-Y30 (סרמיד 3B; בעיקר Noleoyl-phytosphingosine)	Doosan ביוטק ושות', בע ' מ
חומצה אדיפית דיהידרזיד	סיגמא אולדריץ'	A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′- ethylcarbodiimide	סיגמא אולדריץ'	39391
4-(כלורומתיל)בנזואיל כלוריד	סיגמא אולדריץ'	270784
פאקליטקסל	תאגידי Taihua
מסנן מזרק	Sartorius Stedim ביוטק GmbH	17762	15 מ"מ, RC, PP, 0.45 מיקרומטר
RPMI-1640	Gibco Life Technologies, Inc.	11875
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco Life Technologies, Inc.	15070
סרום בקר עוברי	Gibco Life Technologies, Inc.	16140071
Celite (סוכן סינון)	סיגמא אולדריץ'	6858	ראה שלב 1.4