מאמר שיטה

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: טכניקה לקביעת הפוטנציאל הפוטוטוקסי של פוטוסנסיטיזר בעכברים נושאי גידול

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Chang, J. E., et al. יעילות אנטי-סרטנית של טיפול פוטודינמי עם ננו-חלקיקים ממוקדים בסרטן ריאות. J. Vis. Exp. (2016).

טיפול פוטודינמי (PDT) הוא שיטה לא פולשנית ולא ניתוחית לטיפול בסרטן ריאות. פוטוסנסיטיזרים מצטברים באופן סלקטיבי ברקמת הגידול ומובילים למוות תאי הגידול בנוכחות חמצן ואורך גל תקין של אור. סרטון זה מתאר את ניתוח היעילות נגד גידולים in vivo באמצעות photoensitizer המכיל ננו-חלקיקים בעכבר נושא גידול, כדי לקבוע את הפוטנציאל הפוטוטוקסי של הפוטו-נסיטייזר.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. סינתזה של חומצה היאלורונית-סרמיד (HACE)

  1. מסיסים 12.21 mmol של חומצה היאלורונית (HA) oligomer ו-9.77 mmol של tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA) ב-60 מ"ל של מים מזוקקים פעמיים (DDW). מערבבים במשך 30 דקות.
  2. כדי לסנתז את המקשר DS-Y30, יש להמיס 8.59 mmol של DS-Y30 ceramide ו-9.45 mmol של triethylamine ב-25 מ"ל של tetrahydrofuran (THF). מערבבים עם 8.59 mmol של 4-chloromethylbenzoyl chloride ב-THF. יש לערבב במשך 6 שעות ב-60°C.
  3. ממיסים את 8.10 mmol המסונתז של HA-TBA ו-0.41 mmol של DS-Y30 linker בתערובת של THF ואצטוניטריל (4:1, v/v). יש לערבב במשך 5 שעות ב-40°C.
  4. הסר זיהומים על ידי סינון עם סוכן מסנן, ולחסל את הממס האורגני על ידי אידוי ואקום. לטהר את המוצר באמצעות קרום דיאליזה (חיתוך משקל מולקולרי: 3.5 kDa) ו lyophilize.

2. הכנת הננו-חלקיקים

  1. יש להמיס 1 מ"ג HB ו-1 מ"ג פקליטקסל ב-0.5 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ולערבב עם 0.5 מ"ל DDW על ידי ערבוב מערבולות במשך 5 דקות. לאחר מכן, יש להמיס HACE בתערובת זו על ידי ערבוב מערבולות למשך 5 דקות נוספות.
  2. כדי לחסל את הממס, לחמם ב 70 ° C במשך 4 שעות תחת זרם עדין של גז חנקן.
  3. השהה מחדש את הסרט המורכב מ- HACE, HB ופקליטקסל עם 1 מ"ל DDW. סנן עם מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.45 מיקרומטר) כדי להסיר תרופות ללא כמוסות.

3. יעילות אנטי-סרטנית In vivo בעכברים נושאי גידול

  1. מודל עכבר הנגרם מסרטן ריאות
    1. להכין 1 × 106 A549 תאים ב 0.1 מ"ל RPMI-1640 בינוני; לשמור אותו בקרח.
    2. מרדימים את העכברים בהזרקת I.P. של קסילזין ותערובת של טילטמין וזולאזפאם (1:2, 1 מ"ל/ק"ג). ודא הרדמה נאותה על ידי צביטה עדינה של קפל קטן של עור עכבר. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש בזמן הרדמה.
      הערה: אם לא נצפתה תנועה, בעל החיים מורדם מספיק כדי להתחיל את הניסויים.
    3. הזריקו את התאים באופן תת עורי לאגפים השמאליים של עכברים עירומים זכרים מסוג BALB/C (בני 6 - 7 שבועות, 20 - 22 גרם).
    4. המשיכו להתבונן בעכברים עד שיתחילו לנוע בכלוב.
      הערה: אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. שמור על העכברים בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).
    5. למדוד את גודל הגידול עם קליפרים כל יום. חשב את נפח הגידול (מ"מ3) כמו (אורך × רוחב2) / 2. כאשר גודל הגידול מגיע לכ-200 מ"מ3 בנפח, התחל את הניסוי.
  2. מחקר יעילות נגד סרטן
    1. חלקו את העכברים באופן אקראי ל-4 קבוצות (n = 10 לכל קבוצה).
    2. מרדימים את העכברים בהזרקת I.P. של קסילזין ותערובת של טילטמין וזולאזפאם (1:2, 1 מ"ל/ק"ג). ודא הרדמה נאותה על ידי צביטה עדינה של קפל קטן של עור עכבר. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש בזמן הרדמה.
      הערה: אם לא נצפתה תנועה, בעל החיים מורדם מספיק כדי להתחיל את הניסויים.
    3. ממיסים את הננו-חלקיקים ב-PBS לריכוז סופי של 2 מ"ג/מ"ל HB. הזריקו PBS, HB חופשי, HB-NPs או HB-P-NPs דרך וריד הזנב (2 מ"ג/ק"ג כ-HB) פעמיים בימים 0 ו-7.
    4. המשיכו להתבונן בעכברים עד שיתחילו לנוע בכלוב.
      הערה: אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה. יש לשמור על הכלובים חשוכים ובתנאי SPF ספציפיים.
    5. 24 שעות לאחר כל הזרקה, מרדימים את העכברים עם זריקת I.P. של קסילזין ותערובת של טילטמין וזולאזפאם (1:2, 1 מ"ל/ק"ג). ודא הרדמה נאותה על ידי צביטה עדינה של קפל קטן של עור עכבר. יש להשתמש במשחה וטרינרית על העיניים למניעת יובש בזמן הרדמה.
      הערה: אם לא נצפתה תנועה, בעל החיים מורדם מספיק כדי להתחיל את הניסויים.
    6. מניחים את אתר הגידול מתחת לסיב PDT (עם מרחק של 1 ס"מ מסיב ה-PDT לגידול). הרכיבו משקפי בטיחות בלייזר, כבו את המתג והאירו את הגידול בלייזר PDT (630 ננומטר, 400 mW/cm2) למשך 500 שניות (200 J/cm2) פעמיים בימים 1 ו-8.
    7. המשיכו להתבונן בעכברים עד שיתחילו לנוע בכלוב. אין להשאיר בעל חיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על עצם החזה. אין להחזיר בעל חיים שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.
    8. יש לשמור את הכלובים בתנאי SPF. יש לשמור על הכלובים בחושך למשך 24 שעות לאחר טיפול לייזר.
    9. מעקב חזותי אחר נפח הגידול והשינויים באתר הגידול מדי יום. למדוד את גודל הגידול עם קליפרים, ולחשב את נפח כמו (אורך × רוחב2) / 2 (מ"מ3). צלם תמונות של אתרי הגידול מדי יום כדי לבדוק שינויים בפני השטח של הגידול לאחר PDT.
    10. ביום ה-16, יש להקריב חמישה עכברים בכל קבוצה בהרדמה סופנית באמצעות איזופלורן.
    11. בעזרת מלקחיים ומספריים, חותכים את העור החיצוני וחושפים את הגידולים. בזהירות לקצור אותם. תקנו אותם ב-10% פורמלין, הטמיעו אותם בפרפין והכתימו אותם בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) לניתוח היסטולוגי.
    12. לאחר 45 ימים של ניטור, להקריב את העכברים הנותרים על ידי הרדמה סופנית באמצעות isoflurane.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה היאלורונית אוליגו Bioland ושות', בע ' מ
DS-Y30 (סרמיד 3B; בעיקר Noleoyl-phytosphingosine)Doosan ביוטק ושות', בע ' מ
חומצה אדיפית דיהידרזיד סיגמא אולדריץ' A0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′- ethylcarbodiimideסיגמא אולדריץ' 39391
4-(כלורומתיל)בנזואיל כלורידסיגמא אולדריץ' 270784
פאקליטקסל תאגידי Taihua
מסנן מזרקSartorius Stedim ביוטק GmbH1776215 מ"מ, RC, PP, 0.45 מיקרומטר
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
פניצילין-סטרפטומיציןGibco Life Technologies, Inc. 15070
סרום בקר עוברי Gibco Life Technologies, Inc.16140071
Celite (סוכן סינון) סיגמא אולדריץ' 6858ראה שלב 1.4

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

A549Hypocrellin B

מאמרים קשורים