השתלת איי לבלב: שיטה להשתלת איי לבלב לתוך החדר הקדמי של עין העכבר להדמיית In Vivo

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית של Jove

1. הכנת ציוד השתלה ושולחן ניתוחים

הערה: כל כלי הניתוח צריכים להיות אוטומטיים, ואת שולחן הניתוח ואת המכשירים חיטוי עם 70% אלכוהול.

1. חברו מחזיק ראש סטריאוטקסי להרדמה באמצעות מסכת אף והפעילו את כרית החימום.
2. חבר מזרק המילטון אטום לצינורות פוליאתילן וצינורית עין קהה קצה.
   הערה: מומלץ למלא את כל החלקים עם PBS לפני ההרכבה. בדוק אם יש בועות אוויר לכודות והסר אם קיימות.
3. חברו את מזרק המילטון בחוזקה לשולחן (איור 1a) או לבסיס נייד (איור 1e) וחברו את הצינורית למיקרוסקופ הסטריאופוני, כשהצינורית תלויה למטה (כלומר, תנוחת המתנה).
   הערה: השתמש סרט כירורגי, כי קל להסיר ולחבר מחדש.
4. הכינו מזרק 1 מ"ל המחובר למחט 30 גרם מלאה בתמיסת בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג.
5. הכינו מזרק עם PBS סטרילי. לחלופין, השתמשו בפיפטה.
6. הניחו בצד כלוב השכמה נקי עם מנורת חימום.

2. הרדמה ומיקום עכברים מושתלים לניתוח

הערה: כל בעלי החיים גודלו והוחזקו בסביבה נטולת פתוגנים במתקני בעלי החיים באוניברסיטת לונד.

1. הרדימו את העכבר בתא מלא באיזופלורן 40% O₂/60% N₂/3% והעבירו את העכבר המורדם למשטח מחזיק הראש על כרית חימום חמה (איור 1a). בדוק אם אין רפלקסים של דוושות.
   הערה: הרדמה איזופלורנית היא שיטת ההרדמה המועדפת להחלמה מהירה לאחר ניתוח. חדר המיקרוסקופ חייב להיות מאוורר כראוי כדי להשתמש isoflurane.
2. הכניסו את חוטם העכבר למסכת ההרדמה המחוברת למכשיר הרדמה 40% O₂ /60% N₂ 0.9%–1.5% isoflurane. השתמש באגודל ובאצבע כדי להרים מעט את הראש למעלה ולהדק אותו באמצעות חתיכות מתכתיות בצדדים. ודאו שהאוזניות מקבעות את הראש ישירות מתחת לאוזניים. להזריק 0.1 מ"ג / ק"ג תמיסת buprenorphine תת עורית על גב העכבר.
   הערה: Buprenorphine משמש משכך כאבים.
3. הטו את הראש כך שהעין המיועדת לניתוח פונה כלפי מעלה וקרובה לחוקר.
4. משכו בעדינות את עפעפיים העין להשתלה באמצעות מלקחיים קהים, הוציאו את העין החוצה וקבעו באופן רופף עם זוג פינצטה. ודאו שקצות הפינצטה מכוסים בצינור פוליתן המחובר למשטח מחזיק הראש (איור 1a, כניסה).
5. שמור תמיד על שתי העיניים רטובות על ידי מריחת טיפה של PBS סטרילי על העין.
6. העבירו את האיים האנושיים מצינור אטום של 1.5 מ"ל (קטע 1) לצלחת פטרי עם PBS סטרילי וודאו שהאיים קרובים זה לזה כדי למזער את כמות המדיה של תרבית התאים המועברת (איור 1c).
7. להרים ~ 20-30 איים בצינורית העין מחובר באמצעות צינורות פוליתן מזרק המילטון.
   הערה: קח כמה שפחות נוזלים עם האיונים.
8. תלו את הצינור הפוך והתחברו למיקרוסקופ הסטריאו (איור 1d). הדביקו את הצינור בזהירות כדי לאפשר לאיים לשקוע עד קצה הצינורית לכיוון הצינורית.

3. הליך ההשתלה

הערה: שיטה זו תוארה בעבר להשתלת איים עכבריים. מוצג כאן נוהל מעט שונה.

1. צבוט את הרפידות על הרגליים האחוריות כדי לוודא שהעכבר ישן.
2. הדקו את המלקחיים המרסנים את העין מבלי להפריע לזרימת הדם ומרחו טיפת PBS סטרילית על העין.
3. בעזרת מחט 25 גרם כאזמל, משופעים כלפי מעלה, חודרים בזהירות רק למחצית מהקצה בקרנית ומבצעים חתך רוחבי יחיד. הפוך את החור בזווית כלפי מעלה; החור ייאטם בקלות רבה יותר לאחר ההשתלה (איור 1f).
4. בזהירות להרים את הקרנית עם צינורית טעונה מראש עם איים ולאט להחיל איים בעין. הימנעו מהחדרת הצינורית לחדר הקדמי כדי למנוע נזק של הקשתית, אלא דחפו בזהירות כנגד פתח הקרנית (איור 1g). משכו לאט את הצינורית מה-ACE.
   הערה: יש לכוון לנפח הזרקה של 3-8 μL. אם הנפח גדול מדי, הוא יחשוף את העין ללחץ תוך עיני גבוה שלא לצורך ועלול לגרום לריפלוקס של האיים המוזרקים מחוץ לחדר הקדמי.
5. כאשר נתקלים בקשיים בהחדרת האיים עקב לחץ מוגבר בחדר העין, יש להגדיל את אתר החתך על ידי חיזוק אתר החתך הצידי ולהחיל מחדש איונים.
   הערה: לעיתים, ניתן להשתמש בבועות אוויר שהוכנסו כמחזיקי חלל.
6. מרחו את ג'ל העיניים על העין, שחררו את המלקחיים מרסני העין והשאירו את העכבר על איזופלורן באותה תנוחה למשך 8-10 דקות כדי לתת לאיונים לשקוע.
7. הסירו את המלקחיים האוחזים בעפעף והחזירו את העפעף למקומו הרגיל.
8. הסר את העכבר ממחזיק הראש והעבר אותו לכלוב השכמה.
9. כאשר העכבר ער וזז, העבר אותו בחזרה לכלוב המקורי ושמור במגורי בעלי החיים עד לסריקה (מומלץ לפחות 5 ימים).

איור 1: השתלת איים בלבלב לתוך החדר הקדמי של העין.
(א) מערך השתלה המציג עכבר מורדם המקובע במחזיק ראש סטריאוטקסי והעין החשופה (משובץ) ליד מזרק המילטון המוכן המקובע לשולחן והסטריאומיקרוסקופ מוכן לקטיף איי עכבר (ב) או איים אנושיים (ג). (ד) תנוחת המתנה של צינורית העין העמוסה באיונים. (ה) השתלה בתהליך, ו-(ו) שרטוט סכמטי של חתך צדדי יחיד המשמש להרמה זהירה של הקרנית עם קצה צינורית העין ולחלוקת איים לתוך החדר הקדמי (g). תמונה של העין מיד לאחר הזרקת איי עכבר (h) או איים אנושיים (i). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.