אלקטרופורציה אורגנואידית: שיטה להעברת DNA פלסמיד לאורגנואידים במערכת העיכול

תקציר

מקור: Gaebler, A. M.et al.פרוטוקול אלקטרופורציה אוניברסלי ויעיל להנדסה גנטית של אורגנואידים במערכת העיכול. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מתאר את פרוטוקול האלקטרופורציה להעברת פלסמידים גדולים לאורגנואידים תלת-ממדיים במערכת העיכול כדי להוכיח את תפקודו האוניברסלי בישויות שונות, כלומר אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), סרטן המעי הגס (CRC), כולנגיוקרצינומה (CCC) ואורגנואידים של סרטן קיבה (GC).

פרוטוקול

1. תרבית ותכשירים אורגנואידים לפני אלקטרופורציה

1. ביסוס אורגנואידים על ידי עיכול רקמות כפי שתואר קודם לכן והרחבתם עם מדיום התרבית הספציפי לישות המתאימה להם בסקירה כללית של מטריצת מרתף ראה טבלה 1 וטבלת חומרים
   הערה: עבור דגימות רקמה אנושית יש צורך בהסכמה מדעת ובאישור המחקר על ידי ועדה אתית.
2. מחממים מראש צלחות 48 בארות ב 37 ° C עבור זריעה לאחר אלקטרופורציה.
3. הכינו אנטיביוטיקה בינונית בסיסית עם אנטיביוטיקה וכן תרבית אורגנואידים ספציפית לישות עם אנטיביוטיקה (ראו טבלה 1) כולל 10 מיקרומטר Y-27632 ו-3 מיקרומטר CHIR99021.
   הערה: נסיגה של אנטיביוטיקה חשוב כדי להפחית את ההשפעות הרעילות. Y-27632 ו-CHIR99021 משפרים את התאוששות התאים.
4. הכנת האורגנואידים (ראו איור 1)
   1. לטפח 5 בארות של אורגנואידים בצלחת של 48 בארות לכל דגימת אלקטרופורציה במדיום תרבית.
      הערה: יש להשתמש באורגנואידים שגשוגיים (כ 2-3 ימים לאחר הפיצול האחרון).
   2. הכינו 230 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) כולל 10 מיקרומטר Y-27632 לכל באר.
   3. מוציאים את מדיום התרבית מכל באר ומנתקים את האורגנואידים באופן מכני ב-230 מיקרוליטר של תערובת הדיסוציאציה המוכנה. בריכה 5 בארות לכל דגימת אלקטרופורציה לצינור אחד של 15 מ"ל.
   4. מערבבים על ידי מערבולות ודגרים במשך 5-15 דקות ב 37 ° C עד אשכולות של 10-15 תאים להתרחש. לכן, בדוק את הדיסוציאציה מיקרוסקופית. עצור את העיכול על ידי הוספת אנטיביוטיקה בינונית בסיסית עם עד 10 מ"ל
      הערה: צעד זה הוא קריטי מאוד! יעילות האלקטרופורציה תפחת, כאשר הדגירה קצרה מדי, אך עיכול ארוך יפחית את השרידות.
   5. צנטריפוגה בגודל 450 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, יש להשליך את הסופרנאטנט ולשטוף פעמיים עם 4 מ"ל של חיץ אלקטרופורציה (ראו טבלת חומרים).

2. אלקטרופורציה

הערה: הפרוטוקול הבא פותח עבור אלקטרופורטורים המסוגלים להגיע לגלים מרובעים ולהפריד רצפי פעימות נקבוביות והעברה (ראו איור 2). לחלופין, ערכי עכבה כמו גם את המתחים, הזרמים והאנרגיות המועברים לדגימה ניתנים למדידה כבקרה לניסויים הניתנים לשחזור.

1. השהה מחדש את גלולת האורגנואיד ב- 100 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה (ראה טבלת חומרים) המכיל 30 מיקרוגרם DNA פלסמיד.
   הערה: ריכוז ה- DNA של פלסמיד משומש צריך לעלות על 5 מיקרוגרם / μL לריכוז מלח אופטימלי במהלך תהליך האלקטרופורציה. לכן, מומלץ לבצע ערכות מקסי פלסמיד אנדופרי (ראה טבלת חומרים) להכנת וקטורים. ניתן להשתמש בכמות כוללת של עד 45 מיקרוגרם DNA ללא השפעות ציטוטוקסיות.
2. מוציאים את תערובת הדנ"א-אורגנואיד המלאה לקובט אלקטרופורציה עם רוחב רווח של 2 מ"מ מבלי לייצר בועות אוויר.
3. הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה (ראה טבלה 2, איור 2).
4. מערבבים מעט את התאים ללא הקצפה על ידי הקשה על הקובטה באצבע. הכניסו את הקובט לתא הקובטה.
5. לחץ על לחצן Ω של האלקטרופורטור ורשום לעצמך את ערך העכבה.
   הערה: עכבה בין 30-40 Ω הראתה את התוצאות הטובות ביותר. באופן כללי, זה צריך להיות בטווח בין 30-55 Ω. אם זה לא המקרה, אנא שלוט בהיבטים הבאים: רוחב המרווח של הקובט בו נעשה שימוש, חיבורי כבלים של האלקטרופורטור, בועות אוויר אפשריות, נפח נכון וריכוז מלח של תערובת האלקטרופורציה.
6. לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את תוכנית האלקטרופורציה ולשלוט בערכי הזרמים, המתחים והאנרגיות המוצגים.
   הערה: ערכי המתחים, הזרמים והאנרגיות הנמדדים צריכים להתאים לפרמטרים של אלקטרופורציה שנקבעו. לצורך השוואה בין ניסויים חוזרים, כדאי לציין נתונים אלה.
7. לאחר התחשמלות, יש להוסיף מיד 500 מיקרוליטר תרבית בינונית עם אנטיביוטיקה (עם CHIR99021 ו-Y-27632; ראה שלב 1.3). מערבבים על ידי פיטום למעלה ולמטה כדי לנתק את הקצף הלבן.
   הערה: הקצף הלבן מופיע לאחר תהליך האלקטרופורציה ומחובר אליו מספר לא מבוטל של תאים. לכן, דיסוציאציה של זה חשוב מאוד לא לאבד תאים.
8. מעבירים את הדגימה במלואה מהקובטה לצינור חדש של 15 מ"ל באמצעות פיפטה השייכת לקובטות האלקטרופורציה (ראו טבלת חומרים). מומלץ לשטוף שוב את הקובטה בתווך בסיסי כדי להשיג את התאים הנותרים.
9. להתחדשות התאים, לדגור עליהם במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.

3. זריעת תאים

1. צנטריפוגות את התאים ב 450 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
2. השהה מחדש את הגלולה ב 100 μL של מטריצת מרתף זרע 20 μL טיפות בצלחת 48 באר שחוממה מראש (ראה שלב 1.2). לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C עבור פילמור ולהוסיף 250 μL של מדיום תרבית, אשר בתוספת Y-27632 ו CHIR99021 עד הפיצול הבא של אורגנואידים גדל (סביב 5-7 ימים).

4. קביעת יעילות ההעברה

הערה: באופן כללי, מומלץ לחשמל וקטור הנושא סמן פלואורסצנטי כבקרת טרנספקציה נוספת. בהתאם לסמן הנבחר ולהבשלת הכרומופור שלו, הפלואורסצנטיות תיראה בתוך כ-24-48 שעות לאחר הטרנספקציה18.

1. בדקו את הפלואורסצנטיות באופן מיקרוסקופי לאחר 24-48 שעות בבקרת הטרנספקציה (איור 3B)

טבלה 1: הרכב מדיה בסיסית, תערובות עיכול ומצע טיפוח.

רכיבים בינוניים בסיסיים:	אני	השני
DMEM/F-12 מתקדם	-	-
גלוטמקס	1x	1x
Hepes	10 מ"מ	10 מ"מ
פניצילין סטרפטומיצין	-	1x
פרימוצין	1x	-

הקמה על ידי עיכול
תערובת עיכול:	Colon		Stomach		כבד		לבלב
	רגיל	גידולי	רגיל	גידולי	רגיל	גידולי	רגיל	גידולי
קולגנאז II	-	-	-	-	-		0.625 מ"ג/מ"ל
קולגנאז XI	-	0.1 מ"ג/מ"ל	-	0.1 מ"ג/מ"ל	-		-
קולגנאז D	-	-	-	-	2.5 מ"ג/מ"ל		-
דיספאס השני	-	1 מ"ג/מ"ל	-	1 מ"ג/מ"ל	-		2.5 מ"ג/מ"ל
DNase I	-	-	-	-	0.1 מ"ג/מ"ל		-
EDTA	2 מ"מ	-	10 מ"מ	-	-		-
מדולל פנימה	חיץ כלאטי*	מדיום בסיסי I	חיץ כלאטי*	מדיום בסיסי I	in EBSS		מדיום בזאלי I
דגירה עבור:	0.5 שעות על קרח	1 שעות ב-37°C	0.25-0.5 שעות ב- RT	1 שעות ב-37°C	0.5-1 שעות ב-37°C	1.5 שעות ב-37°C	0.5-1 ב-37°C	2-3 שעות ב-37°C
הותאם מהפניה:	Sato et al. 2011		Bartfeld et al. 2015		Broutier et al. 2016		Hennig et al. 2019

% % %

מדיום טיפוח (בסיסי: מדיום בסיסי II)
א83-01	0.5 מיקרומטר	2 מיקרומטר	5 מיקרומטר	0.5 μM
B27	1x	1x	1x	1x
B27 ללא ויטמין A	-	-	1x	-
פורסקולין	-	-	10 מיקרומטר	-
hFGF-10	-	200 נ"ג/מ"ל	100 נ"ג/מ"ל	100 ng/ml
hHGF	-	-	25 נ"ג/מ"ל	-
[Leu15] גסטרין	10 נאנומטר	1 נאנומטר	10 נאנומטר	10 nM
mEGF	50 נ"ג/מ"ל	50 נ"ג/מ"ל	50 נ"ג/מ"ל	50 ng/ml
N2	-	-	1x	-	1x
N-אצטיל-L-ציסטאין	1.25 מ"מ	1 מ"מ	1 מ"מ	1 mM
ניקוטינמיד	10 מ"מ	10 מ"מ	10 מ"מ	10 mM
נוגין	10 %	10 %	-	10
פרימוצין	1x (100 מיקרוגרם/מ"ל)	1x (100 מיקרוגרם/מ"ל)	1x (100 מיקרוגרם/מ"ל)	1x (100 מיקרוגרם/מ"ל)
פרוסטגלנדין E2	10 נאנומטר	-	-	-	1 מיקרומטר
רספונדין	20 %	10 %	10 %	10
SB202190	3 מיקרומטר	-	-	-
Wnt3A	50 %	50 %	-	50
*מאגר כלציה: 5.6 mM Na2HPO4, 8.0 mM KH2PO4, 96.2 mM NaCl, 1.6 mM KCl, 43.4 mM סוכרוז, 54.9 mM d-סורביטול, 0.5 mM dl-dithiothreitol במים מזוקקים

תוצאות

איור 1: תהליך עבודה של הכנת אלקטרופורציה. ראשית, אורגנואידים צריכים להיות מנותקים לצבירים של 10-15 תאים ואנטיביוטיקה צריכה להישטף החוצה. לאחר אלקטרופורציה יש לנתק את הקצף הלבן. ניתן לזרוע תאים לאחר התחדשות במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
[Leu15] גסטרין	סיגמא-אולדריץ'	G9145
א83-01	טוקריס ביוסיינס	2939
DMEM/F-12 מתקדם	Invitrogen	12634010
B27	Invitrogen	17504044
תוסף B27, פחות ויטמין A	תרמו פישר סיינטיפיק	12587010
CHIR99021	סטמג'נט	04-2004
קולגנאז II	לייף טכנולוגיות	17101-015
קולגנאז XI	סיגמא-אולדריץ'	C9407-100MG
קולגנאז D	רוש	11088866001
דיספאס השני	רוש	4942078001
דנאז I	סיגמא-אולדריץ'	D5319
די-סורביטול	רוט	6213.1
Dithiothreitol	תרמו סיינטיפיק	1859330
EDTA	רוט	8040
פורסקולין	טוקריס ביוסיינס	1099
גלוטמקס	לייף טכנולוגיות	35050061
Hepes	תרמו פישר סיינטיפיק	15630106
hFGF-10	פרפרוטק	100-26
KCl	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541
KH2PO4	רוט	3904.2
מטריג'ל	קורנינג	356231	מטריצת מרתף
mEGF	Invitrogen	PMG8043
N2	Invitrogen	17502048
NaCl	רוט	3957.1
Na2HPO4	רוט	K300.2
N-אצטיל-L-ציסטאין	סיגמא-אולדריץ'	A9165
ניקוטינמיד	סיגמא-אולדריץ'	N0636
נוגין	נ.א.	נ.א.	תווך מותנה המופק מתאים HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc)
HGF אנושי רקומביננטי	פרפרוטק	100-39 שעות
רספונדין	נ.א.	נ.א.	תווך מותנה המופק מתאים HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T)
SB202190	סיגמא-אולדריץ'	S7067
טריפל אקספרס	גיבקו	12604021	מגיב דיסוציאציה
Wnt3A	נ.א.	נ.א.	תווך מותנה המופק מתאי L-Wnt3a (מסילביה בוי)
Y-27632	סיגמא-אולדריץ'	Y0503
צלחת 48 בארות	קורנינג	3548
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm מרווח w / פיפטות	Nepa גן ושות', בע ' מ	EC-002S
אלקטרופורטור Nepa21	Nepa גן ושות', בע ' מ	נ.א.
EVOS FL אוטומטי	Invitrogen	AMAFD1000	מיקרוסקופ פלואורסצנטי
EndoFree פלסמיד מקסי קי	קיאגן	12362
Opti-MEM	גיבקו	31985047	חיץ אלקטרופורציה
2 וקטור שרשור gRNA	אדג'ין	84879
פלסמיד PX458	אדג'ין	48138	קידוד עבור sgRNA ו-Cas9
px458_Conc2 פלסמיד	אדג'ין	134449	פלסמיד px458 המכיל 2x מנועי U6 לשני sgRNA שונים