1. עיכול גידולים בלבלב
- הניחו את גידול הלבלב המנותח, גידולים באתר גרורתי או רקמת לבלב בריאה ב-PBS קר כקרח, ואחסנו על קרח.
- השתמשו במלקחיים כדי להעביר את הגידול לצלחת פטרי.
- הוסף 5.0 מ"ל של מדיום העיכול (2 מ"ג / מ"ל Collagenase, 0.025 מ"ג / מ"ל DNase RPMI) לתוך צינור 50 מ"ל; לאחסן על קרח כדי למנוע פעילות אנזימים החלה.
הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-Collagenase Type V, בעל פעילות של ≥1 יחידות/מ"ג FALGPA ו-> 125 יחידות עיכול קולגן (CDU)/מ"ג מוצק. ניתן לאחסן Collagenase ו-DNase aliquots בטמפרטורה של -20°C ולהפשיר על קרח לפני השימוש. כאשר שניהם מסיסים לחלוטין בסל"ד סטרילי, ניתן להעביר אותם דרך מסנן 0.2 מיקרומטר כדי להסיר מזהמים. Collagenase חייב להיות מסיס לחלוטין לפני סינון כדי למנוע אובדן של חומר.
- קח aliquot קטן של פתרון זה כדי לכסות את הגידול על צלחת פטרי.
- השתמש באזמל סטרילי ומלקחיים כדי לחתוך את הגידול לחתיכות קטנות, בערך פחות מ -3 מ"מ אורך.
- מגרדים את חתיכות הגידול לתוך הצינור והופכים בעדינות את הצינור עד שכל החתיכות שקועות במצע העיכול. יש לאחסן על קרח אם יש להכין דגימות גידול אחרות באצווה.
- מעבירים למכשיר ניעור למשך 20 דקות ב-37°C. יש לוודא שכל חתיכות הגידול שקועות ולא דבוקות לקצה הצינור. אם לא ניתן לרעוד, מערבלים את הדגימה כל 5 דקות כדי לסייע לעיכול.
2. הכנת תרחיף חד תאי מגידול מעוכל
- מיד לאחר שלב העיכול, הניחו את הצינורית על קרח כדי להאט את פעילות האנזים.
- הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז סופי של 20 mM ודגימת מערבולת קצרה כדי לערבב. זה יאט עוד יותר את פעילות האנזים.
- פתח את הצינורית ושטוף כל עיכול גידול ממכסה הצינור עם מדיום סל"ד טרי.
- הכינו מסננת בגודל 70 מיקרומטר (ניתן לשנות את גודל המק"מ של המסננת לפי הצורך) על צינור פתוח של 50 מ"ל, על קרח.
- מרטיבים מראש את הפילטר במדיום.
- משעים מחדש את התאים המעוכלים ושוטפים את דפנות הצינור באמצעות פסים של 25 מ"ל, או יותר. הפתח הרחב יותר של הסטריפט חשוב כדי לאפשר לעיכול העבה לעבור בקלות.
- מעבירים את כל התקציר, באמצעות רצועת 25 מ"ל, על המסננת.
- מועכים את הגידול על גבי המסנן באמצעות בוכנה מזרק 1 מ"ל. יש למעוך רק ישירות למעלה ולמטה כדי למזער את לחץ הגזירה לתאים.
- לשטוף ברציפות תאים דרך המסננת עם RPMI. הקפד לשטוף עם מספיק כוח כדי לדחוף תאים דרך.
- אם עדיין יש חומר למעוך, אבל הסל"ד מפסיק לשטוף, המסננת תהיה רוויה. לכן, העבר את הדגימה למסנן חדש והמשך.
הערה: בסופו של דבר יישארו במסנן רק רכיבי מטריצה חוץ-תאיים, שכל התאים הבודדים היו צריכים לעבור דרכם.
- צנטריפוגה את הצינור במשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4 ° C.
- בזהירות להשהות מחדש את גלולת התא בסל"ד מלא ולעבור ישירות דרך מסנן אחר כדי להסיר כל מטריצה חוץ-תאית או גושי תאים גדולים שלא ניתן להשעות מחדש כראוי.
- בשלב זה, אם אין צורך בגירוי, הכתימו מיד את התאים המבודדים לניתוח ציטומטריית זרימה על ידי דילוג לצנטריפוגה של הצלחת למשך 5 דקות ב 300 x גרם ו 4 ° C. הסר את supernatant על ידי הזזת הצלחת הפוכה בתנועה חדה אחת. לחלופין, יש להשהות אותם במדיום הקפאה (10% DMSO ב-FBS) ולאחסן בטמפרטורה של -80°C ולאחר מכן לאחסן לטווח ארוך בחנקן נוזלי.
הערה: שלב ההקפאה יכול לאפשר טיהור של תאי החיסון במועד מאוחר יותר; עם זאת, הכימות של תת-קבוצות תאי החיסון עשוי לדרוש אופטימיזציה כדי לאשר שמספרי התאים והפנוטיפ אינם מושפעים מתהליך ההקפאה/הפשרה. גירוי תאי T ex vivo מבוצע בצורה הטובה ביותר על דגימות גידול טריות. בשלב זה הדגימה יכולה להיות מטוהרת עוד יותר על ידי הסרת תאים מתים מבוססי חרוזים או בדיקות העשרת תאים חיסוניים במידת הצורך.
3. הכנת תאים לגירוי ex vivo
- לספור את התאים כדי להשיג ריכוז של 2 x 106/100 μL בתווך מלא (RPMI 10% FBS, 1X פניצילין ו 1X סטרפטומיצין).
הערה: המספר הגבוה של התאים הכוללים המצופים מבטיח שיהיו מספיק תאי T בתוך מדגם זה לניתוח. עם זאת, ניתן להגדיל או להקטין את המספר בהתאם לזמינות הדגימה ולאופי הנדיר של תת-קבוצות מעניינות של תאי T.
- צלחת 100 μL של תאים בצלחת U תחתית 96 באר
.
- הוסף 100 μL של מדיום שלם המכיל הכנה 2x של PMA / ionomycin (כדי להשיג ריכוז סופי 0.081 μM ו 1.34 μM, בהתאמה, לפי המלצת היצרן).
הערה: אם אתם מודדים דגרנולציה/אקסוציטוזה, כללו כאן גם CD107a מצומד פלואורסצנטית נגד עכבר במדיה. יש לבצע גם דגימת בקרה שאינה מכילה CD107a.
- מקום באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך שעה אחת.
- הוסף 20 μL של הכנה 10x של brefeldin A ו monensin (כדי להשיג ריכוז סופי 1.06 μM ו 2.0 μM, בהתאמה (לפי המלצת היצרן) במדיה מלאה.
הערה: ברפלדין A ומונסין הם מעכבי העברת חלבונים ובכך חוסמים שחרור חוץ-תאי של ציטוקינים וכו', מה שמאפשר את זיהויים על ידי ציטומטריית זרימה. אם מודדים שחרור ציטוקינים לסופרנאטנט על ידי ELISA או שיטות דומות – אז ניתן לדלג על שלב זה.
- מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 4 שעות נוספות.
