הדמיה של דינמיקת סידן בתאי הלבלב: טכניקה לחקר שינויים בזמן אמת בריכוז הסידן הציטוסולי באי הלבלב

תקציר

מקור: Hamilton, A., et. al. Imaging Calcium Dynamics in subאוכלוסיות of Mouse pancreatic Islet cells. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של הדמיה של תאי איון בזמן אמת, כדי לחקור את השינויים בריכוז הסידן הציטוסולי בתת-אוכלוסיות הקטנות של תאי איון הלבלב. ניתן לזהות תת-אוכלוסיות תאים מינוריות באמצעות תגובות תפקודיות לתרכובות סמן, כגון אדרנלין וגרלין, הגורמות לשינויים בסידן ציטוסולי באוכלוסיות ספציפיות של תאי איון. זה יכול לספק תובנה לגבי הדיבור הצולב בין הגלוקוז בדם לבין תפוקת הפרשת האיון.

פרוטוקול

1. טען את הצבע או בטא את החיישן

1. הכינו את הצבע הניתן ללכידה.
   1. ממיסים את האליקוט (בדרך כלל, 50 מיקרוגרם) של הצבע הניתן ללכידה (למשל, Fluo-4) ב-DMSO לריכוז מלאי של 2 מילימול. הוסיפו חומצה פלורונית לריכוז סופי של 1% (באמצעות מלאי של 20% ב-DMSO), כדי לשפר את המסיסות של הצבע.
   2. Aliquot את הצבע צינורות PCR קטנים (2 μL לתוך כל אחד). ניתן לאחסן את הצבע קפוא (-20 מעלות צלזיוס) למשך מספר שבועות.
2. לחלופין, הכינו את החיישן הרקומביננטי.
   1. הפץ את החיישן (למשל קידוד וקטור אדנו-ויראלי GCaMP6f) ל-10 μL aliquots ואחסן בטמפרטורה של -80°C.
   2. (אופציונלי) לבדוק מראש את הטיטר של הזן הנגיפי על ידי הדבקת איים (כמפורט להלן) באמצעות מספר דילולים סדרתיים, כדי לגלות את הריכוז האופטימלי לזיהום.
      הערה: חיישנים רקומביננטיים המקודדים על ידי וקטורים שונים (lentivirus, BacMam, AAV) דורשים פרוטוקול זיהום שונה. הקפד לבדוק זאת עם ספק הווקטור ולייעל את יחס העבודה לצרכים שלך. ניתן לאחסן את המלאי "העובד" של אדנווירוס ב -20 מעלות צלזיוס ולהקפיא / להפשיר מספר פעמים. מחזור הפשרה מוגזם בהקפאה מפחית את הטיטר היעיל של הנגיף.
3. הכן את פתרון ההדמיה.
   1. להמציא את פתרון ההדמיה, mM: 140 NaCl, 4.6 KCl, 2.6 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1 NaH₂PO₄, 5 NaHCO₃, 10 HEPES (pH 7.4, עם NaOH).
   2. מהווים מלאי של גלוקוז (0.5 M) ומניטול (0.5 M) בתמיסת ההדמיה. ניתן לאחסן את המלאי במקרר (4°C) למשך מספר שבועות.
4. טען את הצבע הניתן להשמנה.
   1. המציא את פתרון העבודה של הצבע על ידי המסת 2 μL של הצבע ב 600 μL של תמיסת הדמיה המכילה גלוקוז 6 mM. הפתרון יכול להיות מחומם או מערבל כדי לשפר את מסיסות.
   2. טען את האיים המבודדים לתוך פתרון העבודה של הצבע. ההעמסה יכולה להיעשות באמצעות צלחת multiwell או צלחת פטרי. במקרה האחרון, הניחו טיפה של 100 μL של תמיסת העבודה בתחתית צלחת פטרי לא דבקה (35 או 60 מ"מ) ופיפטה 10-30 איים לתוך הטיפה.
   3. במקרה של קבוצות שונות של איים (למשל סוג פראי / נוק-אאוט), סדרו בארות מרובות וטיפות מרובות כך שניתן יהיה לבצע את ההעמסה בו זמנית.
   4. דוגרים על האיים בתמיסת עיבוד הצבע בטמפרטורת החדר בחושך למשך 70-90 דקות. אין לדגור יתר על המידה.
   5. בדוק את העומס תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי; האיים צריכים לקבל פלואורסצנטיות קלה, כאשר חלק מהתאים בהירים יותר מהשאר. עיגול תאים ולוקליזציה גרעינית של הצבע הם סימנים של עומס יתר.
   6. העבירו את האיים לתמיסת הדמיה נטולת צבע המכילה 6 מילימטר גלוקוז. האיים יכולים לשמש להדמיה באופן מיידי, אך לחלופין ניתן להשאיר את הצבע להסרת האסטריפיקציה למשך 10-15 דקות נוספות. איים ישמרו על הצבע למשך מספר שעות ולכן ניתן להשתמש בהם להדמיה במספר משמרות.
5. לחלופין, הדביקו את האיים בווקטור הרקומביננטי.
   1. לוחצים את האיים בטיפות במדיום גידול RPMI (RMPI1640 (ראה טבלת חומרים), בתוספת 10% של נסיוב עגל עובר, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. מוציאים את התווך לשני צלחות פטרי מפלסטיק 60 מ"מ (לא מטופלות בדבק כלשהו), ושומרים את הכלים באינקובטור (37°C, 5% CO₂, לחות מוחלטת)). (למשל, 30 μL), כדי למזער את נפח הווקטור הדרוש.
   2. הוסף את הווקטור ביחס של כ 10⁵ יחידות זיהומיות / אי שאמור לגרום באופן אידיאלי לריבוי הדבקה >2. באופן אידיאלי יש למטב את היחס ליחס המינימלי שיספק ביטוי בשכבה ההיקפית. קדם-טיטרציה (שלב 1.2.2) עשויה לעזור.
   3. הכניסו 20-50 איים לטיפה ולתרבית למשך 8-48 שעות. (באופן אידיאלי, לילה). איים אמורים לפתח פלואורסצנטיות ירוקה קלושה ברוב התאים, ללא שינויים במורפולוגיה של התא.
      הערה: הצלחת ההדבקה והביטוי תלויה בזמן החשיפה לתמיסת הנגיף. באופן אידיאלי, הנגיף צריך להישאר בתמיסה בן לילה, אך ניתן להסיר אותו לאחר 15 דקות בלבד. עם זאת, ההדבקה, ולכן הביטוי, צפויים להיות נמוכים באופן דרמטי.

2. הדמיה דינמיקה Ca²⁺

1. לשתק את האיים מתחת למיקרוסקופ (ההפוך).
   1. הרכיבו את תא ההדמיה למיקרוסקופ הפוך. מקמו את מכסה הזכוכית (עובי 1 או 1.5) בתוך התא וודאו שממשק תא הזכוכית אטום למים. בדקו שהכיסוי נמצא בהישג יד של מטרת המיקרוסקופ (קריטי במקרה של מטרה מגושמת עם NA גבוה).
   2. הכינו את אביזרי האימוביליזציה. חותכים מלבנים קטנים (20 מ"מ x 20 מ"מ) מהרשת העדינה ומהרשת הגסה. הציגו שני "קירות" ספייסר על הרשת העדינה באמצעות סרט דביק בעובי 45-50 מיקרומטר. השתמש בשכבות כפולות של הספייסר אם גודל האיים לצילום עולה באופן משמעותי על 100 מיקרומטר המקובל.
   3. טבלו את הרשתות ואת המשקולת בתמיסת ההדמיה באמצעות צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. ודאו שהפלסטיק והמתכת רטובים.
   4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, סובבו את הרשת העדינה עם "קירות" הספייסר הפוכים, הספייסרים פונים כלפי מעלה. בחרו מספר איים עמוסים בצבע הניתן ללכידה או מבטאים את החיישן הרקומביננטי עם פיפטה P20 ומקמו אותם בעדינות על גבי הרשת העדינה, בין שני הספייסרים. ודא שהרשת ומכונות הכביסה אינן מכילות כמויות מוגזמות של תמיסת ההדמיה שעליהן.
   5. הרימו את הרשת עם האיונים, באמצעות מלקחיים של שען, ומקמו אותה הפוכה בתוך תא ההדמיה, כך שהספייסרים פונים כלפי מטה ויושבים ישירות על מכסה התא. ודא שהאיים לכודים בין הספייסרים לרשת הכיסוי, באמצע הכיסוי.
   6. מקמו את הרשת הגסה ואת המשקולת על גבי הרשת העדינה בתוך התא. הכנס את פתרון ההדמיה לתא. ודא שהאיים משותקים ומוכנים לצילום. הימנעו מטלטול יתר של התא (הפרעות קטנות כמו נשיאת התא למיקרוסקופ והחדרה לשלב מחומם מקובלות).
      הערה: הסדר אימוביליזציה דומה יכול להיות מיושם עבור מערכת זקופה.
2. הגדר את המיקרוסקופ.
   1. בחר את מצב ההדמיה ואת המטרה, מקם את התא עם האיים משלב 2.1 על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ.
      1. הגדר את בקרת הטמפרטורה (באופן אידיאלי, בין 30 ° C ל 36 ° C) ואת הזלוף. עבור מערכת הפוכה, מקם את זרם הכניסה נמוך יותר מהזרימה בתוך התא, והגדר את שטף הזרימה החוצה להיות גדול מזה של הזרימה (דבר המושג בדרך כלל באמצעות צינור בקוטר פנימי רחב יותר על משאבה פריסטלטית).
      2. ודא שלזרם היוצא יש משטח מגע מינימלי עם התמיסה, כך שהוא מסיר את התמיסה במספר טיפות קטנות רציפות, תוך הימנעות מרווחי זמן ארוכים של הסרת תמיסה רציפה. האחרון הוא המקור העיקרי של חפץ בהדמיה בהילוך מהיר של האותות המחזוריים כפי שהם מופיעים כתנודות עוצמה מחזורית קבועה של כל פיקסל מצולם ומפורשים לעתים קרובות כ"גלים איטיים".
      3. התחל את הזלוף עם פתרון הדמיה המכיל 3 mM גלוקוז.
   2. בחר את נתיב האור ואת המסננים עבור הדמיה של פלואורופורים ירוקים; עירור בין 470 ל 500 פליטה בין 505 ל 550 יעבוד עבור כל אחד מהם.
   3. הפעל הדמיה חיה כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה. התאם את התצוגה כדי ללכוד את האיים המעניינים.
   4. מטב את יחס האות לרעש של התמונה. לשם כך, התאימו את עוצמת אור העירור, את זמן החשיפה ואת הקשירה. ודא שההגדרות מאפשרות הדמיה ברורה של כל תא בתוך האיון בעוצמת האור והחשיפה המינימלית האפשרית.
   5. בצע רכישת תמונה. בהתאם למשימה, תמונות ניתן לקחת ב 0.1 עד 5 הרץ. זה הרבה מתחת לקריטריונים של Nyquist עבור תנודות מהירות מונעות Na⁺ בתאים α ו- δ (>300 הרץ), מה שאומר שהנתונים נמצאים בתת-דגימה כברירת מחדל. עם זאת, הגדלת תדירות הרכישה כדי להתאים לביקוש זה אינה ישימה בהדמיה רב-תאית/מרובת איים עם שדה ראייה גדול. GCaMP ניתן לצלם מהר יותר, בעוד Fluo4 יהיה בלתי נמנע אקונומיקה בתנאי רכישה מהירה.
      הערה: בהתחשב בכך שתנודות _ציט [Ca²⁺] בתאי האיון מונעות על ידי פעילות חשמלית, שימוש בשיעורי רכישה נמוכים עשוי להישמע לא מועיל. במציאות, עם זאת, קצבי רכישה סביב או מעל 1 הרץ עשויים להספיק לפתרון התנהגות דוקרנים של β תאים, בעוד שהסף לזיהוי תנודות מונעות תעלות נתרן בתאים α ו-δ הוא הרבה מעל 300 הרץ. בין אם תנודות _הציט של α או δ תאים [Ca²⁺] נרכשות ב-1 הרץ או ב-0.1 הרץ, הן יעברו תת-דגימה חמורה וישקפו טיפול ב-Ca²⁺ על ידי התא ולא פעילות חשמלית.
      1. בדוק את איכות הנתונים שנרכשו: ב 3 mM גלוקוז, פעילות התא α צריך להיות גלוי / לזיהוי. ודא שזה המקרה והמשך להדמיה בהילוך מהיר בקנה מידה מלא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מטרה של 40x/1.3
GCaMP6f, ב (סוג אדם 5) וקטור אדנו-ויראלי	מעבדות ביולוגיות וקטוריות	1910
סרום בקר עוברי	סיגמא-אולדריץ'	F7524-500ML
סל"ד בינוני	תרמו פישר (GibCo, Life Technologies)	61870044
פניצילין/סטרפטומיצין	תרמו פישר (GibCo, Life Technologies)	15140122
מיקרוסקופ אקסיוברט 200
פלואו4	תרמו פישר (Life Technologies)	F14201