מאמר שיטה

בידוד תאי אצינר ראשוני: שיטה לבידוד תאי אצינר מלבלב עכבר

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Fleming Martinez, A. K., et al. חיקוי ומניפולציה של מטאפלזיה אצינארית לדוקטלית של הלבלב בתרבית תאים תלת ממדית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה המשמשת לבידוד תאי אצינר בלבלב - תאים אקסוקריניים - המכילים מגוון אנזימי עיכול. תאים אצינאריים ראשוניים שימושיים במחקר ex vivo של מטאפלזיה אצינארית לדוקטלית (ADM) - אירוע מוקדם בהתפתחות סרטן הלבלב.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית של Jove.

1. בידוד תאי Acinar

  1. להקריב את העכבר באמצעות אינדוקציה CO 2, ולבצע נקע צוואר הרחם. מיד לנתח את הלבלב. כדי לנתח את הלבלב, תחילה הצמידו את כפות העכבר למכסה הפוליסטירן, כוונו את העכבר כך שהזנב פונה אל החוקר, ורססו את הבטן באתנול 70%.
    הערה: העכבר ששימש בתוצאות המייצגות היה נקבה לא מהונדסת בת 12 שבועות עם רקע C57BL/6. בחירת העכבר נידונה בהמשך פרק הדיון.
    1. בעזרת סט של מספריים ומלקחיים אוטוקלאביים, הרימו את הפרווה/עור עם המלקחיים בקו האמצע והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך דרך הפרווה והעור מפתח השופכה לאזור הסרעפת/כלוב הצלעות.
    2. בצע חתכים נוספים משמאל ומימין כך שהפרווה/העור נחתכים כדי ליצור מבט ברור על חלל הבטן. לאחר מכן, חותכים לתוך רירית הצפק (באמצע וימינה ושמאלה) ומושכים אותה הרחק מהאיברים, כפי שנעשה עם הפרווה/עור.
    3. הרימו את המעיים עם המלקחיים והניחו אותו בצד שמאל של העכבר ויצרו מקום לראות את הלבלב, שצבעו ורוד בהיר, ומחובר לטחול, שהוא אליפסה אדומה כהה. רקמת הלבלב נבדלת על ידי מרקם רך וספוגי שלה. חותכים את הלבלב אשר ירוץ לאורך הבטן ומשתלב עם המעיים.
    4. מפרידים את הטחול מהלבלב. לאחר מכן, שים את הלבלב בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של HBSS עם 1x פניצילין-סטרפטומיצין ולהביא את זה למכסה המנוע זרימה למינרית.
      הערה: השלבים הנותרים של הפרוטוקול צריכים להיעשות תוך שימוש בטכניקה סטרילית במכסה מנוע זרימה למינרית.
  2. יוצקים את הלבלב ואת HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין) לסירת שקילה ריקה, ובעזרת מלקחיים, שוטפים את הלבלב על ידי ערבולו. לאחר מכן, העבירו את הלבלב עם המלקחיים לסירת שקילה שנייה המכילה HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין). שוב, לשטוף את הלבלב על ידי ערבול.
  3. מעבירים את הלבלב לסירת השקילה השלישית HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין) ומתחילים לחתוך את הלבלב לחתיכות קטנות של 5 מ"מ או פחות. לאחר מכן, יוצקים את חתיכות הלבלב ואת HBSS לתוך צינור ריק 50 מ"ל.
    1. כדי לעשות זאת, השתמש במלקחיים כדי להעביר את חתיכות הלבלב לתוך הנוזל בזמן שסירת השקילה מוטה. יוצקים ברגע שכל החתיכות כבר לא מחוברות לסירת השקילה. הרימו את כל החתיכות הנותרות עם המלקחיים ושטפו את המלקחיים בצינור 50 מ"ל המכיל את הלבלב ב- HBSS עם פניצילין-סטרפטומיצין.
  4. צנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את HBSS (וכל שומן צף) על ידי pipeted אותו עם פיפטה 5 מ"ל.
  5. הוסף 5 מ"ל של collagenase (לעשות 40 מ"ל של HBSS + 5% FBS, 20 מ"ל של HBSS + 30% FBS, ו 5 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל collagenase ב HBSS. יש לעקר את הקולגנאז על ידי סינון (נקבוביות של 0.22 מיקרומטר) ולשמור בטמפרטורת החדר. שמור כל אחד מתמיסות HBSS על קרח) ללבלב. ודא מכסה אטום על ידי עטיפת צינור 50 מ"ל בסרט פרפין פלסטיק ולאחר מכן מניחים אותו באינקובטור רועד ב 220 סל"ד למשך 20 דקות ב 37 ° C.
    הערה: זמן העיכול של collagenase עשוי להשתנות, כפי שצוין בדיון. בתום הדגירה לא אמורות להישאר חתיכות גדולות של רקמה.
  6. כדי לעצור את הדיסוציאציה, מניחים את הצינור המכיל את הלבלב על קרח ומוסיפים 5 מ"ל של HBSS קר + 5% FBS. צנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן צינור את supernatant באמצעות pipet 5 מ"ל.
  7. השהה מחדש ב 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS וצנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. Pipet את supernatant באמצעות צינור 5 מ"ל ולחזור על שלב זה עם עוד 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS.
  8. יש להשהות מחדש ב-5 מ"ל HBSS + 5% FBS, ובאמצעות P1000 להעביר 1 מ"ל בכל פעם דרך רשת של 500 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל. הוסף 5 מ"ל נוספים של HBSS + 5% FBS דרך הרשת עם P1000 כדי לשטוף את כל תאי הלבלב הנותרים דרך הרשת.
  9. העבר את מתלה התא מרשת 500 מיקרומטר דרך רשת 105 מיקרומטר על ידי פיפטציה של 1 מ"ל בכל פעם באמצעות P1000. לאחר מכן, צינור בעדינות את תרחיף התא לתוך צינור המכיל HBSS + 30% FBS. שכבה של תרחיף תאים תיווצר בחלק העליון; עם הצנטריפוגה, תאי אצינר ישקעו ויצרו כדור
    10. .
  10. צנטריפוגה ב 233 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה במדיה מלאה של 1x Waymouth.
    1. אם ממשיכים ישירות להטמעת תאים במטריצת קולגן או קרום מרתף, יש להשהות מחדש בנפח של 7 מ"ל לכל לבלב. אם ממשיכים זיהום אדנו-ויראלי או lentiviral, resuspend ב 4 מ"ל לכל הלבלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
37 מעלות צלזיוס אינקובטור רועדתרמו סיינטיפיקSHKE4000-7
5% CO2, 37 °C אינקובטורנואירNU-5500
50 מ"ל צינורותבז352070
רפידה סופגת, 20 אינץ' x 24 אינץ'פישרברנד1420662
מחט גלישה מדויקת BD 21G x 1/2פישר סיינטיפיק305167שימוש כפינים לנתיחה
Beaker, 600 מ"לפישרברנדFB-101-600
צנטריפוגהבקמן קולטראלגרה X-15R צנטריפוגה
Collagenase סוג I, Clostridium histolyticumסיגמאC0130-1Gצור תמיסה של 100 מ"ג/מ"ל על ידי המסת אבקה במים סטריליים ברמה של ביולוגיה מולקולרית. בעת הפשרת aliquot אחד, לדלל ל 10 מ"ג / מ"ל, לסנן לעקר ומניחים 1 מ"ל aliquots ב -20 ° C.
דקסמתזוןסיגמאD1756צור תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל על-ידי המסת אבקה במתנול, שחרור ואחסון בטמפרטורה של -20°C.
אתנול, 200 הוכחותמעבדות דקון2701
סרום בקר עובריסיגמאF0926-100 מ"ל
מלקחייםכלים מדעיים משובחים11002-12
מלקחייםכלים מדעיים משובחים91127-12
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדוםפישר סיינטיפיקSH3048801
דלי קרח, מלבניפישר סיינטיפיק07-210-103
שקיות דגימה של LAB GUARD (לעכבר לאחר נתיחה)מיניגריפSBL2X69S
פארפילםבמיסPM992מכונה בכתב היד 'סרט פרפין מפלסטיק'
PBSפישר סיינטיפיקSH30028.02
פניצילין-סטרפטומיציןתרמופישר סיינטיפיק15140122
קצוות Pipet, 10 μlארה"ב סיינטיפיק1110-3700
קצוות Pipet, 1000 μlאולימפוס פלסטיק24-165RL
קצוות Pipet, 200 μlארה"ב סיינטיפיק1111-1700
פיפט איידדראמונד
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μlגילסוןF144802
PIPETMAN קלאסי P1000, 200-1000 μlגילסוןF123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μlגילסוןF123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μlגילסוןF123601
פיפטה, 10 מ"לבז357551
פיפטה, 25 מ"לבז357525
פיפטה, 5 מ"לבז357543
רשת פוליפרופילן, 105 מיקרומטרמעבדות ספקטרום146436
רשת פוליפרופילן, 500 מיקרומטרמעבדות ספקטרום146418
מספרייםכלים מדעיים משובחים14568-12
מספרייםכלים מדעיים משובחים14568-13
סודיום ביקרבונט (אבקה לבנה עדינה)פישר סיינטיפיקBP328-500
נתרן הידרוקסידיפישר סיינטיפיקS318-500
מעכב טריפסין סויהגיבקו17075029
מריתפישרברנד21-401-10
סטריפליפ 50 מ"ל, מסנני 0.22 מיקרוןמיליפורSCGP00525
קולגן זנב חולדה מסוג Iקורנינג354236
Waymouth MB 752/1 בינוני (אבקה)סיגמאW1625-10X1L
סירה שוקלת, משושה, בינוניתפישרברנד02-202-101

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HBSSFBSWaymouths

מאמרים קשורים