Acinar-to-ductal metaplasia induction: שיטה לחקר התמיינות תא אצינר לתא דוקטלי בתרבית 3D Ex Vivo

תקציר

מקור: Fleming Martinez, A. K. et. al. <a href="https://www.jove.com/v/59096/" target="_blank">חיקוי ומניפולציה של מטאפלזיה אצינארית לדוקטלית של הלבלב בתרבית תאים תלת ממדית. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של התמיינות תאי אצינר בלבלב לתאים דוקטליים בתרבית תלת-ממדית ex vivo. זה עוזר להבין את המנגנונים המווסתים את מטאפלזיה acinar-to-ductal (ADM), תהליך מפתח בהתפתחות מוקדמת של סרטן הלבלב.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת חומרים, פתרונות ובסיסי מטריצה תלת מימדיים

1. חתכו רשתות פוליפרופילן בגודל 500 מיקרומטר ו-105 מיקרומטר לריבועים בגודל 76 מ"מ על 76 מ"מ. קפלו כל ריבוע לשניים פעמיים כדי ליצור ריבוע מקופל קטן יותר. הכניסו ריבוע אחד של 500 מיקרומטר וריבוע רשת אחד של 105 מיקרומטר לתוך שקיק הניתן להרכבה.
2. ריבועי רשת פוליפרופילן Autoclave, כמו גם שני זוגות מספריים ומלקחיים.
3. הפוך 100 מ"ל מהפתרון של 10x Waymouth. יש לערבב בקבוקון 1 (14 גרם) של אבקת Waymouth ב-50 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (DI), וכאשר הם מומסים, להוסיף 30 מ"ל של 7.5% (75 גרם/ליטר) נתרן דו-פחמתי. הביאו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל באמצעות חיטוי מים DI ומסנן.
   1. אחסנו את המדיה של 10x Waymouth בטמפרטורה של 4°C והשתמשו בה להכנת ג'ל קולגן ומדיה אחת של Waymouth. כאשר מזרז צורה, להשליך.
4. הפוך 50 מ"ל של מדיה מלאה של 1x Waymouth לכל לבלב על ידי הוספת 125 μL של 40 מ"ג / מ"ל מעכב טריפסין סויה, 12.5 μL של 4 מ"ג / מ"ל dexamethasone, ו 500 μL של סרום בקר עוברי (FBS). יש לעקר באמצעות סינון ולהשתמש תוך 48 שעות.
5. הכינו בסיסי מטריצה תלת-ממדיים באמצעות מטריצת קולגן או ממברנת מרתף (ראו טבלת חומרים למידע על המוצר). בעת פיטום הבסיס, הניחו את הצלחת על קרח, הימנעו מבועות, וסובבו את הצלחת מיד לאחר צניחת הנפח של כל באר כדי להבטיח כיסוי מלא.
   1. צור בסיסי קולגן על-ידי ערבוב המרכיבים הבאים על קרח בתרבית רקמה: 5.5 מ"ל של קולגן זנב חולדה מסוג I, 550 מיקרוליטר של מדיה של 10x Waymouth, ו-366.6 μL של 0.34 M NaOH (מסונן).
      הערה: זה מספיק פתרון כדי לייצר בסיסי קולגן עבור צלחת אחת של 24 בארות, 12 בארות או 6 בארות. צלחת אחת מספיקה לבידוד מלבלב אחד.
   2. השתמשו בנפחים הבאים כדי לצפות את בסיס הקולגן: 80 μL (שקופית זכוכית של 8 בארות), 200 μL (צלחת של 24 בארות), 400 μL (צלחת של 12 בארות) או 800 μL (צלחת של 6 בארות).
   3. עבור בסיסי מטריצת קרום המרתף, צינור המטריצה ללא רכיבים נוספים. השתמש בנפחים הבאים עבור כל באר: 50 μL (שקופית זכוכית 8 בארות), 120 μL (צלחת 24 בארות), 240 μL (צלחת 12 בארות) או 600 μL (צלחת 6 בארות).
   4. תן לבסיסים להתמצק לפחות 30 דקות באינקובטור תרבית תאים (37 ° C, 5% CO₂) לפני יצירת שכבה שנייה של מטריצה עם תאים משובצים על גבי בסיסים אלה.
6. כהכנה לבידוד יש לשמור על אחת של 600 מ"ל, שלושה צינורות של 50 מ"ל, זוג מספריים אוטוקלאב, זוג מלקחיים אוטוקלאביים ודלי קרח מתחת למכסה המנוע עם שלוש סירות שקילה. לאחר מכן, לעשות 30 מ"ל של HBSS עם 300 μL של 100x פניצילין-סטרפטומיצין, לשים 10 מ"ל לתוך כל אחת משתי סירות שקילה ולשמור את 10 מ"ל הסופי בצינור 50 מ"ל (לשימוש בשלבים 1.8.2 ו 2.1.4).
7. לייצר 40 מ"ל של HBSS + 5% FBS, 20 מ"ל של HBSS + 30% FBS, ו 5 מ"ל של 2 מ"ג / מ"ל collagenase ב HBSS. יש לעקר את הקולגנאז על ידי סינון (נקבוביות של 0.22 מיקרומטר) ולשמור בטמפרטורת החדר. שמור כל אחד מפתרונות HBSS על קרח.
8. הרכיבו חלל עבודה לדיסקציה של הלבלב, אותו ניתן לעשות על ספסל במעבדה.
   1. הניחו פד סופג על השולחן, יחד עם מכסה פוליסטירן מכוסה בנייר כסף. לאחר מכן הניחו מגבת נייר עם 4 פינים על גבי נייר הכסף.
   2. שמור את הפריטים הבאים בהישג יד מסביבת העבודה של הדיסקציה: שקית שריפה, סט אחד של מספריים ומלקחיים אוטוקלאביים, בקבוק תרסיס עם 70% אתנול ודלי קרח (עם צינור 50 מ"ל של HBSS המכיל פניצילין-סטרפטומיצין משלב 1.6).
9. הגדר צנטריפוגה ל 4 ° C ושייקר ל 37 ° C.

2. בידוד תאי Acinar

1. להקריב את העכבר באמצעות אינדוקציה CO₂, ולבצע נקע צוואר הרחם. מיד לנתח את הלבלב. כדי לנתח את הלבלב, תחילה הצמידו את כפות העכבר למכסה הפוליסטירן, כוונו את העכבר כך שהזנב פונה אל החוקר, ורססו את הבטן באתנול 70%.
   הערה: העכבר ששימש בתוצאות המייצגות היה נקבה לא מהונדסת בת 12 שבועות עם רקע C57BL/6. בחירת העכבר נידונה בהמשך פרק הדיון.
   1. בעזרת סט של מספריים ומלקחיים אוטוקלאביים, הרימו את הפרווה/עור עם המלקחיים בקו האמצע והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך דרך הפרווה והעור מפתח השופכה לאזור הסרעפת/כלוב הצלעות.
   2. בצע חתכים נוספים משמאל ומימין כך שהפרווה/העור נחתכים כדי ליצור מבט ברור על חלל הבטן. לאחר מכן, חותכים לתוך רירית הצפק (באמצע וימינה ושמאלה) ומושכים אותה הרחק מהאיברים, כפי שנעשה עם הפרווה/עור.
   3. הרימו את המעיים עם המלקחיים והניחו אותו בצד שמאל של העכבר ויצרו מקום לראות את הלבלב, שצבעו ורוד בהיר, ומחובר לטחול, שהוא אליפסה אדומה כהה. רקמת הלבלב נבדלת על ידי מרקם רך וספוגי שלה. חותכים את הלבלב אשר ירוץ לאורך הבטן ומשתלב עם המעיים.
   4. מפרידים את הטחול מהלבלב. לאחר מכן, שים את הלבלב בצינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של HBSS עם 1x פניצילין-סטרפטומיצין ולהביא את זה למכסה המנוע זרימה למינרית.
      הערה: השלבים הנותרים של הפרוטוקול צריכים להיעשות תוך שימוש בטכניקה סטרילית במכסה מנוע זרימה למינרית.
2. יוצקים את הלבלב ואת HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין) לסירת שקילה ריקה, ובעזרת מלקחיים, שוטפים את הלבלב על ידי ערבולו. לאחר מכן, העבירו את הלבלב עם המלקחיים לסירת שקילה שנייה המכילה HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין). שוב, לשטוף את הלבלב על ידי ערבול.
3. מעבירים את הלבלב לסירת השקילה השלישית HBSS (עם פניצילין-סטרפטומיצין) ומתחילים לחתוך את הלבלב לחתיכות קטנות של 5 מ"מ או פחות. לאחר מכן, יוצקים את חתיכות הלבלב ואת HBSS לתוך צינור ריק 50 מ"ל.
   1. כדי לעשות זאת, השתמש במלקחיים כדי להעביר את חתיכות הלבלב לתוך הנוזל בזמן שסירת השקילה מוטה. יוצקים ברגע שכל החתיכות כבר לא מחוברות לסירת השקילה. הרימו את כל החתיכות הנותרות עם המלקחיים ושטפו את המלקחיים בצינור 50 מ"ל המכיל את הלבלב ב- HBSS עם פניצילין-סטרפטומיצין.
4. צנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להסיר את HBSS (וכל שומן צף) על ידי pipeted אותו עם פיפטה 5 מ"ל.
5. הוסף 5 מ"ל של collagenase (מדולל HBSS בשלב 1.7) ללבלב. ודא מכסה אטום על ידי עטיפת צינור 50 מ"ל בסרט פרפין פלסטיק ולאחר מכן מניחים אותו באינקובטור רועד ב 220 סל"ד למשך 20 דקות ב 37 ° C.
   הערה: זמן העיכול של collagenase עשוי להשתנות, כפי שצוין בדיון. בתום הדגירה לא אמורות להישאר חתיכות גדולות של רקמה.
6. כדי לעצור את הדיסוציאציה, מניחים את הצינור המכיל את הלבלב על קרח ומוסיפים 5 מ"ל של HBSS קר + 5% FBS. צנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן צינור את supernatant באמצעות pipet 5 מ"ל.
7. השהה מחדש ב 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS וצנטריפוגה ב 931 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. Pipet את supernatant באמצעות צינור 5 מ"ל ולחזור על שלב זה עם עוד 10 מ"ל של HBSS + 5% FBS.
8. יש להשהות מחדש ב-5 מ"ל HBSS + 5% FBS, ובאמצעות P1000 להעביר 1 מ"ל בכל פעם דרך רשת של 500 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל. הוסף 5 מ"ל נוספים של HBSS + 5% FBS דרך הרשת עם P1000 כדי לשטוף את כל תאי הלבלב הנותרים דרך הרשת.
9. העבר את מתלה התא מרשת 500 מיקרומטר דרך רשת 105 מיקרומטר על ידי פיפטציה של 1 מ"ל בכל פעם באמצעות P1000. לאחר מכן, צינור בעדינות את תרחיף התא לתוך צינור המכיל HBSS + 30% FBS. שכבה של תרחיף תאים תיווצר בחלק העליון; עם הצנטריפוגה, תאי אצינר ישקעו ויצרו כדור
.
10. צנטריפוגה ב 233 x גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה במדיה מלאה של 1x Waymouth.
    1. אם ממשיכים ישירות להטמעת תאים במטריצת קולגן או קרום מרתף, יש להשהות מחדש בנפח של 7 מ"ל לכל לבלב. אם ממשיכים זיהום אדנו-ויראלי או lentiviral, resuspend ב 4 מ"ל לכל הלבלב.

3. זיהום ויראלי

1. מכיוון שלבלב אחד מספיק לשני זיהומים נגיפיים (בקרה וניסוי, למשל, null ו-cre), פצלו את תרחיף התא בין העפעפיים של שני לוחות בקוטר 35 מ"מ. שימוש במכסה הלוחות מאפשר זיהום בתרחיף ולכן תנועה קלה אל המצע הסופי בהמשך.
   1. בעת עבודה עם וירוס, להשרות את כל קצוות פיפטה משומשים באקונומיקה 10% למשך 15 דקות לפחות.
      הערה: ניצול לוחות 35 מ"מ ונפח 4 מ"ל עובד היטב עבור תאים מעכברים שאינם מהונדסים בין 8 ל -16 שבועות. ייתכן שיהיה צורך להתאים את גודל הצלחת ונפחה, לבעלי חיים עם לבלב קטן או גדול יותר.
2. עבור זיהום אדנו-ויראלי, הוסף את הנגיף (עם טיטר של לפחות 10⁷ TU/mL) בדילול של 1:1,000 למכסה של כל צלחת ומערבולת (איור 1, GFP adenovirus). מניחים את הצלחות באינקובטור תרבית תאים (37°C, 5% CO₂) ומערבלים כל 15 דקות במשך שעה אחת. המשך הדגירה במשך 2 שעות נוספות ולאחר מכן להמשיך להטמעה של תאים קולגן או מטריצת קרום מרתף.
3. לאחר השלמת העבודה הנגיפית במכסה המנוע, יש להשרות את כל רכיבי מכסה המנוע באקונומיקה של 10% למשך 15 דקות לפחות ולאחר מכן לנקות היטב את האקונומיקה באמצעות אתנול 70%.

4. הטמעת תאים במטריצת קולגן או ממברנת מרתף

1. הכינו ג'ל קולגן על קרח על ידי שילוב של קולגן זנב חולדה מסוג I 7 מ"ל (3.3 מ"ג/מ"ל), 700 מיקרוליטר של מדיה של פי 10 של Waymouth ו-466.6 מיקרוליטר של 0.34 מ' NaOH.
2. נוטלים כמויות שוות של ג'ל קולגן ותרחיף תאים, מערבבים בעדינות. אם אתם מוסיפים גירוי או מעכב, שלבו זאת עם תרחיף תאי הקולגן. צלחת אחת בכל פעם (צלחות משלב 1.5.3); שומרים את הצלחת על קרח, מערבלים כדי לפזר באופן שווה את שכבת תאי הקולגן.
   1. בכל באר, pipet את הכמויות הבאות של תרחיף תאי קולגן: 200 μL (8-well זכוכית שקופיות), 500 μL (צלחת 24-well), 1000 μL (צלחת 12-well), או 2000 μL (צלחת 6-well). שימו לב ש-ADM מושרה באמצעות גירוי עם TGF-α (50 ננוגרם/מ"ל) באיור 1.
3. להטמעת תאים במטריצת קרום מרתף, ערבבו מטריצת קרום מרתף בעלת חלק אחד עם השעיית תאים בשני חלקים. כמו עם קולגן, שמרו את מתלה תאי המטריקס כמו גם את הצלחת על קרח. Pipet באר אחת בכל פעם באמצעות אותם נפחים שצוינו ב- 4.2.1 ומערבולת להפצה אחידה.
4. הניחו את הצלחת באינקובטור של תרבית תאים (37°C, 5% CO₂) למשך 30 דקות כדי להתמצק, ואז הוסיפו מדיה שלמה של 1x Waymouth עם כל גירוי או מעכב (איור 1 משתמש ב-TGF-α ב-50 ננוגרם/מ"ל). לשנות את המדיה (עם גירוי או מעכב) למחרת ולאחר מכן פעם ביומיים. בהתאם לגירוי, ADM ניתן לראות בין יום 3 ליום 5.

תוצאות

איור 1: תוצאות מייצגות של תאי אצינר ראשוניים המצופים בקולגן לאחר גירוי עם TGF-α.תאים אצינאריים ראשוניים מעכבר שאינו מהונדס היו נגועים באדנו-וירוס GFP, מוטמעים בקולגן I או במטריצת קרום מרתף, ומגורים עם או בלי TGF-α (50 ננוגרם/מ"ל). עשרים וארבע שעות לאחר ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5% CO2, 37 °C אינקובטור	נואיר	NU-5500
50 מ"ל צינורות	בז	352070
Beaker, 600 מ"ל	פישרברנד	FB-101-600
אדנווירוס, Ad-GFP	מעבדות ביולוגיות וקטוריות	1060
דקסמתזון	סיגמא	D1756	יצירת תמיסה של 4 מ"ג/מ"ל על ידי המסת אבקה במתנול, סילוק ואחסון בטמפרטורה של -20°C
סרום בקר עוברי	סיגמא	F0926-100 מ"ל
מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11002-12
מגלשת זכוכית, 8 בארות	לאב-טק	177402
דלי קרח, מלבני	פישר סיינטיפיק	07-210-103
מטריג'ל	קורנינג	356234	מכונה בכתב היד 'מטריצת קרום מרתף'.
PBS	פישר סיינטיפיק	SH30028.02
פניצילין-סטרפטומיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15140122
צלחת, 12 בארות	קורנינג קוסטאר	3513
צלחת, צלחת 24 בארות	קורנינג קוסטאר	3524
צלחת, 6 בארות	בז	353046
רשת פוליפרופילן, 105 מיקרומטר	מעבדות ספקטרום	146436
רשת פוליפרופילן, 500 מיקרומטר	מעבדות ספקטרום	146418
מספריים	כלים מדעיים משובחים	14568-12
סודיום ביקרבונט (אבקה לבנה עדינה)	פישר סיינטיפיק	BP328-500
נתרן הידרוקסידי	פישר סיינטיפיק	S318-500
מעכב טריפסין סויה	גיבקו	17075029
קולגן זנב חולדה מסוג I	קורנינג	354236
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl	גילסון	F144802
פיפטה, 5 מ"ל	בז	357543
קצוות Pipet, 10 μl	ארה"ב סיינטיפיק	1110-3700
קצוות Pipet, 1000 μl	אולימפוס פלסטיק	24-165RL
קצוות Pipet, 200 μl	ארה"ב סיינטיפיק	1111-1700
פיפטה, 25 מ"ל	בז	357525
פיפט אייד	דראמונד
פיפטה, 10 מ"ל	בז	357551
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl	גילסון	F123601
PIPETMAN קלאסי P1000, 200-1000 μl	גילסון	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl	גילסון	F123600
Waymouth MB 752/1 בינוני (אבקה)	סיגמא	W1625-10X1L
סירה שוקלת, משושה, בינונית	פישרברנד	02-202-101