כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
כלי הניתוח הדרושים מוצגים באיור 1 והתרשים הסכמטי של ההליך מוצג באיור 2.
1. פתרונות
- הכינו את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) על ידי הוספת 100 מ"ל HBSS 10X (מהמלאי) ל-900 מ"ל מים מזוקקים ליצירת 1 ליטר HBSS (1X).
- הכינו תמיסת STOP (חייבת להיות טרייה ויש להשתמש בה תוך שעה) על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי 100X (FBS) ל-450 מ"ל של 1X HBSS קר כקרח; זה מייצר תמיסת STOP של 500 מ"ל. שמור על תמיסת STOP בטמפרטורה של 4°C.
- הכן תמיסת collagenase P (חייב להיות טרי בתוך 1 שעה של שימוש) על ידי הוספת 1 מ"ג / מ"ל של collagenase P קר כקרח 1X HBSS; להשתמש 6 מ"ל / עכבר.
- הוסף 0.05% (w/v) אלבומין בסרום בקר (BSA) לתמיסת collagenase P (זה מספק חומרים מזינים לאיים המבודדים). לדוגמה, יש להשתמש ב-3 מ"ג BSA בתמיסת 6 מ"ל של collagenase P. יש לשמור על קרח.
- חשב והכן את כמות collagenase P הדרוש לכל העכברים בצינור אחד של 50 מ"ל.
- הכן RPMI 1640 בינוני מלא על ידי הוספת 10% FBS, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, תוסף תא INS-1 (10 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, ו 0.05 mM 2-mercaptoethanol) ל 500 מ"ל RPMI 1640 מדיה המכילה 5.5 mM גלוקוז לשימוש עבור תרבית לילה דגירה.
2. הכנה
- מלא שלוש צינורות 50 מ"ל של 25 מ"ל RNase מעכב פתרון, 70% אתנול או מזוקק H2O. פתרונות אלה ישמשו לניקוי כלים כירורגיים לפני ובמהלך ההליך.
- השרו את קצות הכלים בתמיסת מעכבי RNase למשך 30 דקות לפני תחילת הפרוטוקול; זה מבטל כל RNase פוטנציאלי על הכלים.
- חתכו מראש רפידות סופגות לגודל 6 על 6 אינץ' לשימוש במהלך הניתוח.
- הכינו מראש תמיסת HBSS 1X ואחסנו בטמפרטורה של 4°C. הכינו את תמיסת STOP לפני הניתוח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכינו תמיסת collagenase P מיד לפני הניתוח ואחסנו על ice.
הערה: זה צריך לשמש בתוך 2 שעות של הכנה.
- תווית 50 מ"ל צינורות לעיכול וטיהור; להכין 2 צינורות עבור כל עכבר, אחד לעיכול והשני לטיהור איון. ודא שתעודת הזהות של בעל החיים נמצאת בשני הצינורות.
- הוסף 3 מ"ל של תמיסת collagenase P לצינור 50 מ"ל הראשון. 3 מ"ל הנותרים של collagenase P יוזרקו.
- משוך את 3 מ"ל הנותרים של תמיסת collagenase לתוך מזרק 3 מ"ל רכוב עם 30 גרם 1/2 במחט. מניחים את המזרק על קרח.
3. נוהל
- הסר את כל הכלים מתמיסת מעכב RNase, ולאחר מכן טבול אותם תחילה בצינור עם 70% אתנול, לאחר מכן בצינור המכיל H2O מזוקק, ולאחר מכן יבש באוויר על מגבת נייר נקייה.
- הניחו את העכבר בתא המכיל 0.5 מ"ל של איזופלורן עד להרדמה עמוקה של העכבר.
- הסר עכבר מהחדר ובדוק את מצב ההרדמה על ידי צביטת כרית כף רגל עם מלקחיים. הרדמה עמוקה מבוססת על התצפית שהנשימה נעשית איטית בהתמדה והעכבר אינו מגיב לצביטה ברגל. לאחר אישור כי העכבר מורדם עמוק, להרדים את העכבר עם נקע צוואר הרחם, ולאחר מכן להניח את העכבר על כרית סופג.
- מניחים עכבר מורדם על בטנו, מפעילים לחץ על הצוואר ומנתקים את עמוד השדרה מהמוח על ידי משיכת זנב.
- הדביקו את איברי העכבר במצב שכיבה לכרית הסופגת, רססו את הגוף באתנול 70% ונגבו את עודפי האתנול.
- השתמש במלקחיים מזכוכית כיסוי ובמספריים כירורגיים מעוקלים כדי לבצע חתכים. ראשית לבצע חתך אופקי על העור של אזור הבטן (~ 3 ס"מ), למשוך את העור פתוח לרווחה כדי לחשוף את דופן הבטן. לאחר מכן בצעו חתך אנכי (~3-4 ס"מ) בצפק הבטן כדי לחשוף באופן מלא את הלבלב בחלל הבטן (איור 3).
- אם תדחפו את האונות של הכבד בצורה מעולה כדי לחשוף את צינור המרה, הוא ייראה כצינור ורוד בהיר (איור 3).
- הזיזו בזהירות את המעיים מהאזור המותני/איליאק הימני של חלל הבטן ימינה, וחשפו את צינור המרה ועורק הכבד (איור 3).
- הדקו בזהירות את צינור המרה המשותף באמצעות מיקרו סרפינים של שוורץ (איור 1) קרוב ככל האפשר לכבד.
- זהה את אמפולה של Vater, אשר ממוקם על פפילה התריסריון, שנוצר על ידי האיחוד של צינור הלבלב ואת צינור המרה המשותף. האמפולה של Vater נראית נפוחה כאשר מסתכלים עליה תחת מיקרוסקופ דיסקציה שהוא נקודת הכניסה לצינור המרה המשותף (איור 4).
הערה: התאמת עוצמת / זווית האור של מיקרוסקופ הדיסקציה יכולה להקל על איתורו.
- הכנס את המזרק עם 3 מ"ל של תמיסת collagenase P לתוך אמפולה של Vater. דחפו את המחט לתוך הצינור בערך 1/4 מאורך צינור המרה המשותף (אמפולה מובילה לתוך צינור) כפי שמוצג באיור 5.
- ברגע שהמחט נמצאת באמפולה, ודא שהכיוון של המחט הוא כזה שהוא מקביל לצינור.
- ייצבו את המחט על-ידי הידוק עם מלקחיים מיקרו אדסון כדי למנוע ממנה לנקב את הצינור (איור 5).
- הזריקו לאט ובהתמדה 3 מ"ל של תמיסת collagenase P מהמזרק לתוך צינור המרה המשותף (מספיק כדי להרגיש התנגדות) כפי שמוצג באיור 6. המטרה היא ליצור לחץ זרימה אחורית כדי לאלץ את הקולגנאז להיכנס לצינור הלבלב. הזרקה נחשבת מוצלחת אם אזור הראש, הצוואר, הגוף והזנב של הלבלב מנופחים במלואם.
הערה: תשואת האי תהיה נמוכה אם הלבלב אינו מנופח במלואו, או שאזור הטחול אינו מנופח במלואו. האזור הטפלני מכיל את המספר הגבוה ביותר של איים6. האינפלציה יכולה להיות מאושרת על ידי הופעת שטחים פתוחים בין רקמת הלבלב כי הם מלאים פתרון.
- נתחו בזהירות את הלבלב המנופח והניחו אותו בצינור עיכול של 50 מ"ל המכיל 3 מ"ל של תמיסת קולגנאז P קרה כקרח.
- מוציאים את הלבלב בעזרת 2 מלקחיים (מעוקל ומיקרו אדסון; ראו איור 1): (מתחילים מהטחול, משכו את הלבלב הרחק מהטחול והמשיכו להסיר מהקיבה ולאורך התריסריון.
הערה: אין צורך בחתכים.
- קוצצים את הלבלב במשך 3-5 שניות בצינור העיכול עם 3 מ"ל של תמיסת קולגנאז P קרה כקרח באמצעות מספריים כירורגיים עדינים (איור 7A).
- חבר את הצינור למתלה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C ונער במהירות 100-120 סל"ד למשך כ-12-13 דקות.
- לאחר הדגירה, נערו בעדינות את הצינורות ביד כדי לשבש את הרקמה עד שתמיסת העיכול של collagenase P הופכת הומוגנית (איור 7B). הומוגניות מאושרת על ידי מראה דמוי חול של חלקיקים עדינים של הלבלב. בדרך כלל מספיקות כ-30 שניות של לחיצת יד עדינה. החזק את הצינור לאור כדי לבחון אם הרקמה הומוגנית היטב; נערו עוד ~ 15 שניות במידת הצורך.
- לאחר העיכול, הניחו מיד את הצינורות על קרח והוסיפו 40 מ"ל של תמיסת STOP קרה כקרח כדי לסיים את העיכול האנזימטי.
הערה: בשלב זה צינורות העיכול ניתן להשאיר על קרח עד 2 שעות, אם עובדים על עכברים מרובים.
- צנטריפוגה הצינור בצנטריפוגת דלי מתנדנד ב 300 x גרם במשך 30 שניות (הטמפרטורה של צנטריפוגה גמישה).
הערה: השתמש בצנטריפוגת דלי מתנדנדת, כך שגלולת הרקמה נוצרת בתחתית הצינור של 50 מ"ל ולא על דופן הצינור; זה קריטי לתפוקת איים טובה יותר.
- דק וחזור על הצנטריפוגה עם תמיסת STOP 2 פעמים נוספות, ונטרל את התמיסה לאחר כל סיבוב. השתמש ב- 20 מ"ל של תמיסת STOP עבור כל שטיפה עוקבת.
- לפני כל סיבוב, שבש את הגלולה על ידי ניעור עדין של גלולת הרקמה בצינור 50 מ"ל בתמיסת STOP של 20 מ"ל.
- להשהות מחדש את גלולת הרקמה עם 40 מ"ל של HBSS קר כקרח וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 שניות.
- דקרו וחזרו על הצנטריפוגה באמצעות צנטריפוגת דלי מתנדנד עם תמיסת HBSS פעמיים נוספות, תוך פירוק התמיסה לאחר כל סיבוב. יש להשתמש ב-20 מ"ל HBSS לכל כביסה.
- לפני כל סיבוב, שבש את הכדורית, כדי לנתק אותה מתחתית הצינור על ידי ניעור עדין של הצינור המכיל 20 מ"ל תמיסת HBSS.
- לאחר הצנטריפוגה האחרונה להסיר את כל HBSS.
- לאחר מכן הוסף 5 מ"ל של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור 50 מ"ל המכיל את הכדור. מערבולת לזמן קצר במהירות נמוכה עד הומוגנית.
- הוסף עוד 5 מ"ל של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור 50 מ"ל. אין לערבב/לערבב.
הערה: זה קריטי להישאר יציב ודומם כדי לאפשר שיפוע טוב יותר להיווצר ללא הפרעה.
- פיפטה 10 מ"ל של חיץ HBSS בטמפרטורת החדר לתוך הצינור (המכיל את שיפוע הצפיפות), טיפה אחר טיפה בעדינות ובאיטיות כדי לאפשר לשיפוע להיווצר. השתמש אקדח פיפטה עם פיפטה 10 מ"ל כדי להוסיף HBSS dropwise.
- באמצעות צנטריפוגת דלי מתנדנדת, סובבו צינורות במהירות של 1700 x גרם למשך 15 דקות. הקפידו לשנות את מהירות ההאצה/האטה להגדרה הנמוכה ביותר כדי לשמור על השיפוע (איור 7C).
- לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את הצינורות מבלי להפריע לשיפוע. באמצעות אקדח פיפטה שהורטב מראש עם HBSS קר (פיפטה HBSS למעלה ולמטה), פיפטה החוצה את שכבת האיים (5-10 מ"ל) שנוצרה בין שיפוע הצפיפות לבין HBSS לתוך צינור איסוף האיונים החדש של 50 מ"ל.
הערה: כדאי להרטיב את הפיפטה עם HBSS קר לפני הפיפטה, כדי למנוע מהאיים להידבק לדפנות הפנימיות של הפיפטה.
- במקרה שההפרדה אינה שלמה, איים ייראו בשכבת שיפוע הצפיפות, ויוציאו את כל 10 מ"ל שיפוע הצפיפות (השכבה התחתונה) יחד עם שכבת האיון שנוצרה בממשק (רק כדי להשאיר כ-8-10 מ"ל מהשכבה העליונה של HBSS מאחור).
הערה: איסוף שכבת האיון ושכבת שיפוע הצפיפות (השכבה התחתונה) יכול לגרום לאיסוף פסולת שעשויה להאריך את זמן קטיף האיון, אך לא ישתנו שלבים אחרים. איסוף שתי שכבות אלה אינו הכרחי כאשר שכבת האיון נוצרת היטב.
- הוסף 20 מ"ל של HBSS קר כקרח לצינור החדש של 50 מ"ל המכיל איונים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 350 x גרם למשך 3 דקות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת.
- לאחר הסיבוב, בזהירות פיפטה (לא decant) החוצה את supernatant (להשאיר ~ 3 מ"ל בתחתית) מבלי להפריע את הגלולה המכילה את האיים בתחתית. השליכו את הסופרנטנט.
- יש לחזור על השטיפה והצנטריפוגה לפחות 3 פעמים. הוסף 20 מ"ל HBSS בכל פעם, והקפד להשהות את הגלולה לפני כל סיבוב.
- יש לחמם את בקבוק המדיה המלא RPMI-1640 באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, הסר את כל HBSS והוסף 4 מ"ל של מדיה RPMI-1640 מלאה שהוכנה בעבר (המכילה FBS, תוספת תא INS-1 ופניצילין/סטרפטומיצין) לכדור.
- עקרו את הגלולה על ידי ערבול עדין של הצינור ומיד שפכו את המדיה RPMI-1640 לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ. הוסף עוד 5 מ"ל של מדיה RPMI-1640 לצינור ולערבל אותו בעדינות כדי לשטוף את כל האיים שנותרו, ולאחר מכן גם לשפוך את המדיה לתוך אותה צלחת פטרי.
- תחת מיקרוסקופ דיסקציה, בחרו איים בריאים מצלחת הפטרי באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר, והכניסו אותם לצלחת פטרי חדשה המכילה 10 מ"ל של מדיה מלאה של RPMI 1640. כאשר מסתכלים תחת מיקרוסקופ דיסקציה, איים צריכים להיראות בצבע כדורי/מלבני וחום-זהוב עם משטח חלק בהשוואה לרקמה האקסוקרינית השקופה יחסית.
הערה: הגדלה של מיקרוסקופ דיסקציה נקבעה בדרך כלל על 12.5-16x. תנובת האייל תשתנה בהתאם לגורמים שונים, כולל זן, גיל ומין העכבר. פרוטוקול זה מניב בדרך כלל 250-350 איים בריאים מעכבר C57BL/6J בריא בגיל 4-10 חודשים.
- לדגור על האיים באינקובטור סטרילי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם עירוי של 5% CO2 ו-95% אוויר לח למשך הלילה לניסויים למחרת, או להקפיא את האיים לניתוח הרצוי במועד מאוחר יותר.
- ברגע שהאיים מוקפאים, לא ניתן להשתמש בהם לבדיקות הפרשה, אלא רק לכימות RNA או חלבונים. כדי לאסוף תאים להקפאה, מקמו אותם במאגר HBSS, אספו את כל האיים בחיץ של 200–500 מיקרוליטר, העבירו לצינור 1.5 מ"ל, צנטריפוגה 350 x גרם למשך 1-2 דקות, הסירו את הסופרנאטנט ולא השאירו יותר מתמיסת 30-40 מיקרוליטר, הניחו ב-20°C לאחסון לטווח קצר (מספר ימים) או -80°C לאחסון לטווח ארוך.
