צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים: טכניקה לניתוח ספרואידים לביטוי ביטוי אנטיגן תוך תאי וחוץ-תאי

תקציר

מקור: Cavaco, A. C. M. et al. מודל ספרואידי תלת-ממדי כמערכת פיזיולוגית יותר למחקרי פיברובלסטים הקשורים לסרטן ופלישה במבחנה. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים כדי להבין את ההבחנה של פיברובלסטים או CAFs. פרוטוקול זה מסייע לזהות ביטוי של אנטיגנים תוך-תאיים וחוץ-תאיים, כולל שקיעת חלבוני ECM בתוך הספרואידים.

פרוטוקול

1. צביעה אימונופלואורסצנטית של ספרואידים

1. אספו את הספרואידים לאחר כ-24 שעות לתוך צינור תגובה אחד של 1.5 מ"ל לכל מצב ניסויי או לכל חלבון שיש לנתח. לדוגמה, מקמו את הספרואידים של iNFs שעוררו עם TGF-β1 בצינור שונה מתאי הבקרה iNFs, שלא טופלו. כדי למנוע קרע של ספרואידים עקב כוחות גזירה חזקים מדי, לחתוך את קצה פיפטה קצה כדי להגדיל את הפתח. כלול לפחות 5-10 ספרואידים בצינור תגובה אחד, כדי לאפשר שכפול ולקחת בחשבון את ההפסדים האפשריים במהלך שלבי הכביסה.
2. צנטריפוגה את הספרואידים עם צנטריפוגה עליונה ספסל במשך כ 30-60 שניות ב 1,000 x גרם. הסר בזהירות את supernatant המכיל מתילצלולוז על ידי pipetting, מבלי להפריע spheroids כדורי.
3. יש לשטוף עם 50 μL של 1x PBS. חזור על שלב הצנטריפוגה והסר בזהירות את PBS על ידי צנרת, כמתואר ב 1.2.
4. בהתאם לחלבון שיש להכתים, יש לתקן עם 50 μL של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (עבור αSMA, NG2 ואינטגרין α3β1) או עם 50 מיקרוליטר מתנול למשך 10 דקות ב-20°C (עבור תת-יחידות למינין-332).
5. חזור על שלב הכביסה כפי שמוסבר בשלבים 1.2-1.3.
6. חדרו לתאים עם 0.1% Triton-X ב-PBS למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
7. חזור על שלב הכביסה כפי שהוסבר בשלבים 1.2-1.3 שלוש פעמים.
8. דגרו על הספרואידים ב-PBS המכילים 5% FBS ו-2% BSA, למשך שעה אחת ב-RT כדי לחסום אתרי אינטראקציה לא ספציפיים עם חלבונים.
9. לדגור את הספרואידים עם 30 μL של נוגדנים ראשוניים PBS, 2.5% FBS ו 1% BSA ב 4 ° C במשך הלילה. נעשה שימוש בנוגדנים העיקריים הבאים: אנטי-αSMA Cy-3 מצומד ואנטי-NG2 ב-5 מיקרוגרם/מ"ל; BM2 אנטי-למינין α3, 6F12 אנטי-למינין β3 ואנטי-למינין γ2 20 מיקרוגרם/מ"ל.
10. חזור על שלב הכביסה כפי שהוסבר בשלבים 1.2-1.3 שלוש פעמים.
11. לדגור על הספרואידים עם 30 μL של נוגדנים משניים ב- PBS, 2.5% FBS ו- 1% BSA ב- RT למשך 90 דקות. הנוגדנים המשניים הבאים בהם נעשה שימוש היו: Alexa 488 נגד ארנב ונגד עכבר (5 מיקרוגרם / מ"ל).
12. חזור על שלב הכביסה כפי שהוסבר בשלבים 1.2-1.3 שלוש פעמים.
13. יש לדגור על התאים עם 30 μL של תמיסת צביעה DAPI למשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
14. חזור על שלב הכביסה כפי שמוסבר בשלבים 1.2-1.3.
15. מניחים את הספרואידים על מגלשת זכוכית, בטיפת PBS, באמצעות פיפט פסטר זכוכית.
16. דמיינו את הספרואידים במיקרוסקופ פלואורסצנטי במיקרוסקופ סורק לייזר באמצעות הגדלה של פי 10. קח חתך אופטי שונה של הספרואיד במישורים אופטיים שונים של מחסנית z (15-20 מישורי מחסנית). כדי לקבוע את הגדרות הלייזר במיקרוסקופ, השתמש בכדוריד המורכב מתאים שליליים לאנטיגן המעניין או בכדוריד המוכתם רק בנוגדן המשני. השתמש שוב באותן הגדרות עבור כל הדגימות שיושוו
.
17. נתח את התמונות המיקרוסקופיות באמצעות תוכנת ImageJ כפי שפורסמה בעבר. השלבים מסוכמים באיור 1. כרקע, קבע את צפיפות האות המשולבת של אזור עניין ללא תאים (ROI). חשב את פלואורסצנטיות התא המתוקנת הכוללת (TCCF) כ:
    TCCF = צפיפות אות משולבת - (שטח הספרואיד שנבחר x פלואורסצנטיות ממוצעת של הרקע)
18. קבע את הפלואורסצנטיות המתוקנת הכוללת (TCF) של הספרואידים כאשר ה- TCCF מנורמל לאזור הספרואיד ומספר הערימות.
    TCF = TCCF של ספרואיד / (שטח הספרואידים x מספר הערימות)

תוצאות

איור 1. שלבים עוקבים לכימות הצביעה האימונופלואורסצנטית של חלבון בעל עניין בספרואידים, באמצעות ImageJ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI)	סיגמה-אולדריץ'	D9542-10
6F12 תת-יחידה אנטי-למינין β3 עכבר (חד-שבטי)			תוצרת בית
אלבומין חלק V - BSA	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 עז (רב-שבטית) נגד עכבר	Invitrogen	A11029
אלקסה פלואור 488 ארנב עז (רב שבטי)	Invitrogen	A11034
אנטי למינין γ2 תת-יחידה עכבר (חד שבטי)	סנטה קרוז	SC-28330
צנטריפוגת ספסל	פישר סיינטיפיק	50-589-620	נבט
BM2 נגד למינין α3 תת-יחידה עכבר (חד-שבטי)			באדיבות פרופ' פטרישיה רוסל, CNRS, ליון
צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל	קורנינג	430290
מיקרוסקופ קונפוקלי	זיס
DMEM (גלוקוז גבוה 4.5 גרם / ליטר)	לונזה	BE12-604F
פיברובלסטים ראשוניים של הלבלב האנושי	PELOBiotech	PB-H-6201
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
שקופיות מיקרוסקופ	תרמו סיינטיפיק	J1800AMNZ
פרפורמאלדהיד	רידל-דה האן	16005
טריטוןX-100	סיגמה-אולדריץ'	X100RS