תרביות קו-תרביות ספרואידים תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית: שיטה לגידול משותף של תאים סרטניים ופיברובלסטים

תקציר

מקור: Noel P. et al.הכנה ובדיקה מטבולית של תרביות משותפות ספרואידיות תלת ממדיות של תאי סרטן הלבלב ופיברובלסטים. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מסביר את ההדפסה הביולוגית המגנטית התלת-ממדית של תאי סרטן הלבלב והפיברובלסטים בתרבית משותפת. תאי סרטן הלבלב ותאי פיברובלסט פעילים של הלבלב מתורבתים בתרבית משותפת וממוגנטים באמצעות מכלול ננו-חלקיקים תואם ביולוגית, ליצירת ספרואידים, בהשפעת כוחות מגנטיים.

פרוטוקול

1.תרבית סרטן הלבלב ספרואידים תלת ממדיים באמצעות הדפסה ביולוגית מגנטית

1. באמצעות טכניקת תרבית רקמה אספטית סטנדרטית, תרבית תאים בעלי עניין בבקבוק T75 למפגש של 70-80% במצעי גדילה מתאימים.
   הערה: בדרך כלל, 5-7 × 10⁶ תאים מבקבוק T75 70-80% מפגש נקצרו. במחקר זה נעשה שימוש בשני סוגי תאים שונים - Patu8902 (תאי גידול בלבלב) ותאי PS1 (תאי סטלט פעילים של הלבלב). שני קווי התאים גודלו בתרבית במדיה 1640 של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI-1640) בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), 1× פניצילין-סטרפטומיצין (p/s).
2. יש לשטוף תאים פעם אחת עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS).
3. נתק תאים מפני השטח של פלסטיק על ידי טריפסיניזציה עם 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למשך 5-10 דקות ב-37°C. בדוק אם יש ניתוק תאים תחת מיקרוסקופ.
4. נטרל טריפסין על ידי תוספת של 8 מ"ל מצע גדילה לתאים מנותקים. הימנע טריפסיניזציה יתר, כמו זה יכול להשפיע לרעה על הבריאות / כדאיות של תאים.
5. תאי Pipet למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף תא בודד ולספור צפיפות תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
6. בינתיים, יש לאזן בקבוקון של NS לטמפרטורת הסביבה.
7. חישוב כמות התאים הדרושה לזריעת המספר הרצוי של ספרואידים (בארות) ו aliquot לצינור חרוטי חדש 15 מ"ל. לדוגמה, כדי לזרוע צלחת שלמה של 96 בארות עם 5,000 תאים / באר, aliquot לפחות 5.5 × 10⁵ תאים.
8. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 3 דקות. בזהירות asp לנטרל או decant את supernatant ולהשהות מחדש את התאים בריכוז של 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל במצע גידול. פיפטה משתמשת בעדינות בקצה פיפט רחב ומשועמם כדי למנוע גזירה. לדוגמה, להשעות מחדש 5.5 x 10⁵ תאים ב 550 μl של מדיה צמיחה.
9. מגנט את כמות התאים הרצויה באמצעות NS שיווי משקל (שלב 1.6).
   1. הוסיפו ישירות NS לתרחיף התא במצע הצמיחה ועצבו בעדינות. לתיוג מגנטי יעיל של תאים, יש להשתמש ב-10 μL NS לכל 100 μL תאים (מרחפים מחדש ב-1 x 10⁶ תאים/מ"ל).
      הערה: עבור ניסוי טיפוסי, סמן 5.5×10⁵ תאי Patu8902 ב- 550 μL עם 55 μL NS ו- 1.1×10⁶ תאי PS1 ב- 1100 μL, (בנפרד) עם 110 μL NS.
   2. הפוך בעדינות את הצינור מספר פעמים כדי להבטיח את השעיית התא. באופן זמני, מעבירים את תערובת התא-NS לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות. עשו זאת בנפרד כדי שכל סוג תא יהיה ממוגנט. יש לכסות את הצלחת ולדגור על תאים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם ניעור עדין כדי לאפשר קשירה של NS לפני התא.
      הערה: תרבית ובדיקה של ספרואידים החל מתאי Patu8902 או PS1 בלבד, בנוסף לתרבית משותפת ספרואידים החל משני סוגי התאים שעורבבו מראש לפני הדפסה על כוננים מגנטיים הושגו בהצלחה בשיטה זו בניסויים עצמאיים. שיטה ליצירת ספרואידים בתרבית משותפת מתאי Patu8902 ו- PS2 מתוארת להלן בשלבים הבאים.
10. יש לערבב בעדינות את התאים הממוגנטים מעלה ומטה כדי לערבב באופן אחיד ולהכין תערובת אב המכילה את מספר התא הרצוי. לזריעת ספרואידים, השתמש בסך הכל ב- 15,000 תאים (5,000 Patu8902 + 10,000 PS1) והתאם לנפח כולל של 150 μL לכל באר של צלחת 96 בארות.
    הערה: הנפח הסופי שהופץ לכל באר חייב להיות זהה ללא קשר למספר התאים המשמשים.
11. הניחו צלחת דוחה תאים בעלת 96 בארות על גבי כונן ספרואיד מגנטי בעל 96 בארות והזרימו 150 מיקרוליטר של תערובת תאים לכל באר. התבוננו בתאים שנאספים באיטיות למרכז הבאר שמעל המגנט. כסו ודגרו על הצלחת למשך הלילה באינקובטור CO₂ של 5% המוגדר בטמפרטורה של 37°C כאשר כונן הספרואיד המגנטי עדיין מחובר. הסר את הכונן המגנטי ודגר לצמיחה נוספת עד 7 ימים.
    הערה: חיוני להשתמש בלוחות גדילה דוחי תאים להדפסה ספרואידית באמצעות כוננים ספרואידים מגנטיים. ודא שנעשה שימוש בכונן הספרואיד עם מגנטים קטנים דקים יותר, ולא בכונן ההחזקה.
12. לפקח על הצמיחה של spheroids כל יום. חדש עם מדיה צמיחה טרייה כל שלושה ימים על ידי הנחת צלחת הצמיחה רכוב על כונן מחזיק מגנטי בזווית באמצעות צינור רב ערוצי כדי למשוך מדיה משומשת.
    הערה: תאי Patu8902 ו-PS1 שנזרעו יחד ב-15,000 תאים/באר יגדלו לכדוריות תלת-ממדיות בקוטר של 400-600 מיקרומטר תוך 5-7 ימים. בשלב זה הספרואידים מוכנים לאפיון מטבולי, הערכת תרופות ויישומים אחרים במורד הזרם.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.05% טריפסין EDTA	סיגמא	25300-054
96 צלחת דוחה תאים היטב	ארה"ב סיינטיפיק / גריינר ביו-וואן	655970	צלחת גדילה ספרואידית
סלומטריה שקופיות ספירת תאים	Nexcelom	CHT4-SD100-002
כונן ספרואיד מגנטי n3D	ננו3D ביומדע	655841	חלק מערכת ההדפסה הביולוגית Spheroid
n3D מגנטי Spheroid holding כונן	ננו3D ביומדע	655841	חלק מערכת ההדפסה הביולוגית Spheroid
n3D NanoShuttle-PL	ננו3D ביומדע	655841	חלק מערכת הדפסה ביולוגית ספרואידית: יש לאחסן ב-4°C
Patu8902 תאים	מלאי מעבדה		אדנוקרצינומה של צינור הלבלב תאים
תאי PS1	מלאי מעבדה		תאי סטלט פעילים של הלבלב
RPMI1640	גיבקו	11875-093	מצע גדילה לתאים, ספרואידים