1. בדיקה מטבולית של ספרואידים תלת-ממדיים של גידולי לבלב עבור מסלולים ביואנרגטיים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי
הערה: בחלק זה מתואר ניתוח הפונקציות המטבוליות של הספרואידים באמצעות מנתח שטף חוץ-תאי עם מיקרו-צלחות בדיקה שתוכננו במיוחד עבור ספרואידים תלת-ממדיים.
- שטיפה והעברה של ספרואידים מצולחות גדילה למיקרו-צלחות בדיקה ספרואידיות.
הערה: ניתן להשתמש בספרואידים לבדיקות מטבוליות כאשר הם מגיעים לקוטר של ~500 מיקרומטר.
- יום לפני ביצוע הבדיקה, לחות את הגשושית או מחסנית החיישן עם כיול הבדיקה (200 μL / באר) בצלחת השירות שסופקה ודגור לילה (4-18 שעות) באינקובטור לח (לא CO2) מוגדר על 37 ° C.
- הכן את מדיום הבדיקה המתאים לבדיקה המטבולית הרצויה על ידי השלמת אמצעי הבסיס (ראה טבלת חומרים) עם 2 mM L-גלוטמין לבדיקת מאמץ גליקוליזה (GST) או עם 1 mM פירובט, 2 mM L-גלוטמין ו 10 mM גלוקוז עבור בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי (MST) assay.
הערה: מנתח השטף החוץ-תאי מודד הן נשימה מיטוכונדריאלית (OCR) והן גליקוליזה (ECAR) של תאים חיים בפורמט צלחת של 96 בארות. שיעורים אלה מספקים סקירה כללית של תפקוד חילוף החומרים התאי בדגימות הנחקרות. עיין במדריך שבערכות הבדיקה לקבלת הוראות מפורטות.
- לאחר הוספת תוספים ספציפיים לבדיקה (עיין בשלב 1.1.1), חממו את מדיום הבדיקה המתוסף באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס וכווננו את ה- pH ל- 7.4 ± 0.1 עם 0.1N NaOH. יש לשמור על חום המדיום עד לשימוש.
- הרכיב מחדש ריאגנטים של ערכת בדיקה בריכוז המלאי המכויל בינוני עד מומלץ.
הערה: אלה נעשים ב 10× הריכוז הסופי הרצוי בארות. ריכוזי המלאי של גלוקוז, אוליגומיצין ו-2-דאוקסי-גלוקוז (2-DG) הם 100 מילימול, 100 מיקרומטר ו-500 מילימול, בהתאמה.
- התבוננו בספרואידים בלוח הגידול תחת מיקרוסקופ אור כדי לבדוק את המורפולוגיה של הספרואידים ואת האחידות הכללית; מבחינת הצורה והמבנה של הספרואידים.
- העבירו את לוחית הגדילה לכונן אחיזה מגנטי ושאפו בזהירות ~ 120 μL מצע צמיחה. שטפו בעדינות ספרואידים עם ~120 μL של מדיית בדיקה מחוממת ומכויילת מראש, שאפו וחזרו על השטיפה פעמיים. בדוק שוב את הספרואידים מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהספרואידים אינם נשטפים.
- הכן את microplate assay spheroid על ידי הוספת 180 μL מדיה בדיקה חמה לכל באר.
- הגדר מיקרופיפטה P20 ל 10 μL ולהתאים קצה משועמם רחב אליו. אם אין קצוות משועממים רחבים, חתכו את קצות הפיפטה הרגילים בעזרת מספריים נקיים או אזמל כדי להרחיב את השעמום.
הערה: זה אמור להפחית את הגזירה ולשמר את המורפולוגיה הכוללת של הספרואידים בזמן שהם מועברים ללוחות בדיקה.
- יש להשתמש במשטח חם (37°C) כדי לבצע העברה של ספרואידים. השתמש במשטח צופה סרטי רנטגן שחומם באמצעות מנורת אור לבן כדי לשפר את הניגודיות ולסייע בהדמיה של ספרואידים במהלך תהליך ההעברה.
- יש לשאוף בזהירות ספרואיד יחיד שנשטף מראש מצלחת הגידול דוחה התאים באמצעות מיקרופיפטה P20 המצוידת בקצה רחב ולהעביר בעדינות ספרואיד ישירות למרכז כל באר של צלחת בדיקה ספרואידית לביצוע הבדיקה המטבולית. אפשר לכל ספרואיד ליפול בעדינות לתוך תא המיקרו המרכזי של כל באר על ידי כוח הכבידה הטהור כדי לאכלס את צלחת הבדיקה.
הערה: בדרך כלל לוקח 5-8 שניות לכל ספרואיד ליפול למרכז הבאר על ידי כוח הכבידה. אין לשלוף את פיפטה עד שהספרואידים התיישבו בתא המיקרו. אין להפקיד ספרואידים בארבע הבארות הפינתיות של צלחת הבדיקה (A1, A12, H1, H12) מכיוון שאלו ישמשו כבארות רקע.
- עקוב אחר המורפולוגיה והמיקום של כל ספרואיד כדי לוודא שכל ספרואיד נמצא במרכז כל באר. במידת הצורך, מקם מחדש למרכז הבאר על ידי שאיפת ספרואיד באמצעות קצה צינור רחב משעמם, ולאחר מכן שיקוע על ידי כוח הכבידה.
- לאחר שכל הספרואידים הועברו, הניחו את צלחת הבדיקה באינקובטור אוויר לח של 37 מעלות צלזיוס (שאינו CO2) למשך שעה אחת לפני הבדיקה.
- טעינת מחסנית חיישן עם תרכובות וביצוע הבדיקה
- הכן ריאגנטים ספציפיים לבדיקה מרוכזת 10× במדיה הספציפית לבדיקה המתוארת בשלב 1.1.2. לדוגמה, כדי לבצע GST, לשחזר גלוקוז, אוליגומיצין, ו 2-DG בנפחים המומלצים המוזכרים במדריך הבדיקה. בדיקות GST ו- MST בוצעו באמצעות ספרואידים Patu8902-PS1.
- כוון כראוי את מחסנית החיישן עם שורות המסומנות A-H בצד שמאל והנח מדריך טעינה על גבי מחסנית החיישן. ודא טעינה נכונה של היציאה הרצויה על ידי כיוון מדריך הטעינה כך שהאות המתאימה ליציאה לטעינה תהיה בפינה השמאלית העליונה.
- באמצעות פיפטה רב ערוצית, לחלק ריאגנטים ישירות לתוך יציאות הזרקה. החזק את קווי העזר לטעינה במקומם באמצעות קצות האצבעות לאורך כל ההליך.
הערה: כל מגיב יוזרק ליציאה מומלצת המוזכרת במדריך הבדיקה. הימנע מיצירת בועות אוויר, אך אל תקיש על חלק כלשהו של המחסנית כדי להסיר בועות אוויר.
- הסר את מדריך הטעינה ואת המיקום בגובה העיניים עם המחסנית כדי לבדוק חזותית את יציאות ההזרקה לטעינה אחידה.
- צור את תכנון הניסוי/פרוטוקול המכשיר באמצעות תוכנת Wave של בקר המכשירים (להלן, תוכנת ניתוח) כמתואר בסעיף 1.3.
- תכנון וביצוע Assay באמצעות תוכנת הניתוח
- יצירת תבנית בדיקה עבור הניסוי
- פתח את תוכנת הניתוח ולחץ על "תבניות" או בחר מתוך תבנית בדיקה קיימת. לחץ פעמיים על "תבנית ריקה".
- הגדר קבוצות ניסוי ותנאים.
- הגדר אסטרטגיות הזרקה עבור יציאות A, B ו- C. השאר את יציאה D ריקה.
הערה: עבור בדיקת GST, רק יציאות אלה יהיו טעונות עם גלוקוז, אוליגומיצין ו 2-DG. במקרה של בדיקת MST, אוליגומיצין, FCCP ורוטנון יועמסו.
- הגדירו טיפולים מקדימים אם ספרואידים טופלו בתרכובת בדיקה אחת או יותר ובקבוצת הביקורת. הגדר את מדיית הבדיקה כך שתכלול מקור, תוספות ומידע אחר.
- הגדר סוג תא אחד או יותר (לדוגמה, Patu8902, PS1) המציג את נתוני הצפיפות ומספר המעבר.
- לחץ על "צור קבוצות".
- לחץ על הכרטיסייה "מפת לוחות" והקצה קבוצות ללוח הבדיקה המתאים לעיצוב הניסוי.
- בחר את ארבע הבארות הפינתיות כבארות רקע. ודא שאין ספרואידים בבארות אלה.
- הפעל בדיקה על המנתח
- לחץ על הכרטיסייה Instrument Protocol. שמור את פקודות פרוטוקול ברירת המחדל על ידי סימון "כיול", "שיווי משקל" ו"מחזור מדידה בסיסי".
- לחץ על "הזרקות" והגדר תרכובת לכל יציאה. ערוך מחזורי מדידה ל- 6 מחזורים מ- 3 מחזורי ברירת המחדל עבור ספרואידים. שמור על ברירת המחדל של תמהיל של 3 דקות, 0 דקות המתנה ו- 3 דקות מדידת זמנים.
הערה: זמני התמהיל-המתנה-מדידה המוגדרים כברירת מחדל הם 3 דקות, 0 דקות, 3 דקות, בהתאמה. שלוש מדידות קצב בסיס נלקחות בדרך כלל לפני הזרקת תרכובת הבדיקה הראשונה. מדידות אלה ניתנות לכיול והתאמה מחדש בהתאם לתכנון הניסוי.
- פרוטוקול סקירה וסיכום קבוצה.
- שמור תבנית עיצוב assay.
- המשך לכיול לפני הבדיקה לאחר שיציאות ההזרקה הועמסו במצעי מבחן. העבר את המחסנית עם לוחית השירות למנתח השטף החוץ-תאי.
הערה: פעולה זו מסתיימת בדרך כלל תוך 15-20 דקות ומכיילת את החיישנים לביצוע מדידות OCR ו- ECAR.
- לאחר כיול המחסנית, החלף את לוחית השירות בלוח הבדיקה שחומם מראש המכיל ספרואידים תלת-ממדיים והתחל את הבדיקה. לאחר השלמת המדידות, יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני או לתוכנת גרפים וסטטיסטיקה כדי לנתח את הנתונים.
