בידוד תאי גזע PDAC: שיטה לבידוד תאי גזע סרטניים מגידולי לבלב

תקציר

מקור: Lonardo, E., et al. חקר מאפייני תאי גזע של סרטן הלבלב לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות. J. Vis. Exp. (2015).

מאמר זה מתאר את הטכניקה לבידוד תאי גזע סרטניים של הלבלב (CSC) מרקמת אדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי (PDAC). CSCs אלה משמשים לחקר ההשפעות הפונקציונליות של טיפול תרופתי על יכולת ההתחדשות העצמית במבחנה של CSCs לפיתוח טיפולים יעילים יותר בסרטן.

פרוטוקול

1. בידוד של CSCs מ-PDAC אנושי (איור 1)

1. בארון בטיחות ביולוגית סטרילי, העבירו את רקמת ה-PDAC האנושית לצלחת תרבית בגודל 60X15 מ"מ המכילה 1 מ"ל של מלח סטרילי 1X חוצץ פוספט (PBS). טוחנים את הגידול לחתיכות קטנות (1 - 5 מ"מ) באמצעות אזמל סטרילי ומלקחיים.
2. מוסיפים 1 מ"ל של 1X PBS סטרילי לצלחת התרבית וחוזרים על שלב הטריטורציה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין, באופן קבוע זה דורש 3-4 סיבובים. מעבירים את מתלה הרקמה (למעלה עד נפח סופי של 5 מ"ל עם 1X PBS) לתוך צינור סטרילי והומוגניזציה מכנית עם דיסוציאטור כגון gentleMACS.
3. לדגור על הרקמה ההומוגנית עם collagenase (להשתמש 2.5 מ"ג / מ"ל של collagenase ב 1X PBS) במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 900 x גרם. דקנט את supernatant ו resuspend את כדורי התא ב 10 מ"ל של תווך מלא. סנן את מתלה התא דרך מסננת 40 מיקרומטר וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 900 x גרם.
4. דקרו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה עם 5 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (אמוניום-כלוריד-אשלגן, ACK), ודגרו על
5. יש להשהות מחדש את הגלולה בתווך CSC, לצלוח על צלחת מצופה ג'לטין ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת. שלב זה יסיר את רוב תאי הפיברובלסטים המתחברים במהירות לצלחת.
6. הסר את הצלחת מן האינקובטור בזהירות לשחזר את השעיית התא לכמת את מספר תאים קיימא (טריפאן כחול-שלילי) באמצעות המוציטומטר. למטרה זו, מערבבים בעדינות את המתלה ואת פיפטה 20 μl של המתלה לתוך צינור אפנדורף. הוסיפו 20 μl (יחס של 1:1) של כחול טריפאן לתאים בצינור המיקרוצנטריפוגה וערבבו היטב. פיפטה בערך 10 μl של תערובת על hemocytometer.
7. ספור את כל התאים השקופים בתוך ארבעת הרבעים הפינתיים של תא הספירה לספירת תאים בת קיימא.
   הערה: הכדאיות והתשואה של תאים עשויים להשתנות במידה ניכרת בין דגימות גידול. עבור דגימות PDAC הכדאיות נעה באופן קבוע בין 45-70%, וחתיכות רקמה מדגימת גידול מקרוסקופי בקוטר של 3 - 5 מ"מ אמורות להניב כ- 5x10⁶ תאים ברי קיימא.

תוצאות

איור 1. מטפורמין מכוון באופן סלקטיבי ל-CSC.
(A) מטפורמין הקטין את גודל הכדורים. תמונות מייצגות של כדורים המתקבלים לאחר הטיפול עם המינונים המצוינים של מטפורמין במשך 7 ימים (פאנל ימני). כימות גודל הכדור (n≥6) (פאנל שמאלי), המספרים המצוינים בציר אבסיס מייצגים גידול בודד. (B) יכולת היווצרות כדור בנוכחות או היעדר מטפורמין במשך 7 ימים (n≥6), המספרים המצוינים בציר absc...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא ספירה/ המוציטומטר	האוזר סיינטיפיק	3200
CASY Cell Counter and Analyzer להתרבות ומדידת כדאיות	Roche Innovatis	AG CASY דגם TTC 45,60,150 מיקרומטר
דיסוציאטור GentleMACS	Miltenyi ושות	130-093-235
צינורות GentleMACS C	Miltenyi ושות	130-093-237
צלחות תרבית רקמה 100 מ"מ	BD בז	353803
מסננת תאים	BD בז	352350
15-ml פוליפרופילן חרוטי צינור	BD בז	352097
50-ml פוליפרופילן חרוטי צינור	BD בז	352070
1.5 מ"ל צינורות סטריליים	אפנדורף	0030 120.086
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה	קורנינג	430828
צלחות פטרי סטריליות, מנות 10 ס"מ	קורנינג	353003
Collagenase סוג IV	טכנולוגיות תאי גזע	7909
RPMI בינוני 1640	טכנולוגיות חיים	11875-085
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין, פי 100	טכנולוגיות חיים	SV30010
ל-גלוטמין, 200 מילימול, פי 100	טכנולוגיות חיים	25030-081
תוסף B27 פי 50	טכנולוגיות חיים	17504-044
גורם גדילה פיברובלסט בסיסי	סיגמא	F0291
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	סיגמא	D8437
סטרילי 1x מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	סיגמא	D8537
כחול טריפאן	טכנולוגיות חיים	15250-061
אינקובטור עם קלט CO2
מיקרו מספריים
מלקחיים מעוקלים
מלקחיים סדקים