בדיקת היווצרות כדור: שיטת מבחנה לזיהוי תאי גזע של סרטן הלבלב וטיפולי מסך

תקציר

מקור: Lonardo, E. et al. חקר מאפייני תאי גזע של סרטן הלבלב לפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשות. J. Vis. Exp.(2015).

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לפיתוח ספרואידים של תאי גזע סרטניים בלבלב במבחנה. הבדיקה יכולה לשמש ככלי סינון לזיהוי תרכובות שעלולות להתמקד בתאי גזע סרטניים.

פרוטוקול

1.Sphere Forming Assay and Analysis

1. בדיקת היווצרות כדור וטיפול במטפורמין
   1. קח את מספר התאים הנדרש והוסף את הנפח המתאים של CSCs בינוני כדי להכין ריכוז תא של 2,000 תאים / מ"ל. אין לשמור את תרחיף התא על קרח למשך לא יותר משעה אחת ולערבב היטב לפני הציפוי.
   2. הוסף 500 μl של 1X PBS לשורה הראשונה והאחרונה של צלחת 24 בארות ללחות על מנת לסייע במזעור אידוי בינוני. זרעו את התאים לתוך לוחות תאי התקשרות נמוכים במיוחד בצפיפות של 2,000 תאים לבאר ב 1 מ"ל של תווך כדור הגידול (2,000 תאים / מ"ל).
      הערה: מספר התאים המשמשים לבדיקות היווצרות כדורי הגידול עשוי להשתנות בין סוגי הגידולים.
   3. לטפל לפחות 4 בארות עם רכב (בקרה שלילית) ו 4 בארות עם כל טיפול שהוקצה, למשל, 3 mM של מטפורמין. מקם את התאים באינקובטור המוגדר ל 37 ° C וספק את התאים עם 5% CO₂ למשך שבוע אחד.
      הערה: אין לשנות את המדיום על מנת לאפשר היווצרות בלתי מופרעת של כדורי גידול, אך ניתן למלא אותו בגורמי גדילה על בסיס יומיומי מכיוון שהם אינם יציבים בתווך התרבית.
   4. אחת ליומיים מוסיפים טיפול, למשל 3 מילימטר מטפורמין או רכב לכל אחת מהבארות. להעריך את מספר כדורי הגידול שנוצרו לאחר 5 ו/או 7 ימים באמצעות מונה תאים אוטומטי המאפשר ספירה של מבנים גדולים יותר (איור 1).
      הערה: רק כדורי גידול עם לפחות 40 מיקרומטר צריך להיחשב והוא יכול להיות מסווג קטן (40 - 80 מיקרומטר) או גדול (80 - 120 מיקרומטר), בהתאמה. ניתן להמחיש את התוצאות כאחוז כדורי הגידול חלקי המספר הראשוני של תאים שנזרעו (למשל, 2,000 תאים).
2. מעבר סדרתי של כדורי גידול מהדור הראשון
   1. לאחר 7 ימים של דגירה, קצרו את כדורי הגידול באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר וצנטריפוגו אותם למשך 5 דקות במהירות של 900 x גרם ב- RT.
   2. לנתק את הגלולה של כדורי הגידול לתאים בודדים באמצעות טריפסין, ולאחר מכן להרחיב את תא בודד המתקבל תאים בודדים השעיה שוב במשך 7 ימים נוספים.

תוצאות

איור 1. טיפול במטפורמין מעכב את צריכת החמצן וגורם לייצור ROS. (A) תוספת מטפורמין מעכבת צריכת חמצן (OCR) של תאים שמקורם בכדור. שני כדורים משניים שונים של PDAC טופלו במטפורמין ושינויים בזיהוי תווים אופטי (OCR) נמדדו על ידי ניתוח שטף חוץ-תאי. הזרקת רוטנון שימשה כבקרה על צריכת OCR מיטוכונדריאלית כוללת. ציר X מייצג את קצב צריכת החמצן ב-pmol של חמצן/שעה המנורמל על ידי תכו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 צלחות חיבור נמוכות במיוחד	קורנינג	3474
סטרילי 1x מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	סיגמא	D8537
מטפורמין	סיגמא	D150959-5G
תמיסת טריפסין, 0.05%	טכנולוגיות חיים	25300054
אינקובטור עם קלט CO2
CASY Cell Counter and Analyzer להתרבות ומדידת כדאיות	Roche Innovatis	AG CASY דגם TTC 45,60,150 מיקרומטר
תא ספירה/ המוציטומטר	האוזר סיינטיפיק	3200
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה	קורנינג	430828
15-ml פוליפרופילן חרוטי צינור	BD בז	352097
50-ml פוליפרופילן חרוטי צינור	BD בז	352070