1. הכנת ספרואידים גידוליים תלת ממדיים מוטמעים ב- ECM
- הכינו עמדת עבודה עם החומרים הדרושים בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי.
- הכינו תערובת מדוללת של בדיקות נותב פלואורסצנטי בקוטר 1 מיקרומטר מעובד קרבוקסילט על ידי הוספת 2 בדיקות מלאי חלקים (2% מוצקים) ל-25 חלקים מים סטריליים.
- הוציאו מהמקרר בקבוק קולגן בקר במינון 3.1 מ"ג/מ"ל והניחו אותו על קרח.
- Aliquot 125 μl של קולגן לתוך בקבוקון ריק 2 מ"ל.
- הוסף 50 μl של תמיסת בדיקה נותבת מדוללת לבקבוקון המכיל את הקולגן והמערבולת לזמן קצר כדי להפיץ את הבדיקות.
- הוסיפו 235 μl של תרבית תאים מתאימה המכילה פנול אדום (שיהפוך צהוב) לנפח כולל של 410 מ"ל ומערבולות לזמן קצר לפני הסרת 205 מ"ל (מחצית מהנפח הכולל) והכנסתם לבקבוקון חדש של 2 מ"ל. בקבוקון 1 יכיל את ספרואיד הגידול ובקבוקון 2 יהיה תערובת ביקורת.
- הוסף ~ 2 μl של 1 M NaOH לבקבוקון 1 כדי להחזיר את התמיסה ל- pH ניטרלי (מדיה תרבותית המכילה אדום פנול צריכה לחזור לאדום). שימו לב שזה יגרום לתערובת להתחיל להחלים אם היא לא נשמרת על קרח. מערבבים לזמן קצר כדי לערבב, ואז חוזרים מיד למדף הקרח.
הערה: הספרואיד בקושי נראה לעין בלתי לאחר 9 ימי תרבית והסרתו ממיטת האגרוז היא משימה עדינה. שימוש במיקרוסקופ דיסקציה עשוי להועיל לחלק מהמשתמשים. שמירה על שלמות הספרואיד במהלך ההעברה היא בעלת חשיבות עליונה.
- בעזרת קצה פיפטה רחב פה, להסיר בעדינות 40 μl של מדיה מן הבאר המכילה את spheroid הגידול. שמור על 40 μl זה בעת ביצוע השלב הבא.
- בדוק את הבאר כדי לראות אם הספרואיד הוסר בשלב הקודם. אם כן, הוסף את 40 μl המכיל את הספרואיד לבקבוקון 1. אם לא, החזירו את 40 μl לבאר וחזרו על השלב הקודם.
- מערבבים בעדינות בקבוקון 1 (אין להסתכן במערבולת, זה עלול לפגוע בספרואיד) לפני העברת התערובת במנות של 60 μl לשלוש בארות נפרדות של צלחת 96 בארות. בדוק כל באר במיקרוסקופ לאחר הוספת תערובת כדי לקבוע איזו באר מכילה את הספרואיד.
- הוסף ~ 2 μl 1 M NaOH ו 40 μl של מדיה תרבית תאים בקבוקון 2 מערבולת לפני aliquot 60 μl של תערובת זו לבאר ריקה בצלחת 96 באר ותיוג כבקרה.
- מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי לרפא למשך שעה לפחות.
2. בנה רשת של נקודות לדוגמה וצלם סרטון בכל נקודה
- מעבירים את צלחת הדגימה משלב האינקובטור לשלב המיקרוסקופ. המתינו 10 דקות עד שהדגימה תתאזן עם טמפרטורת החדר אם שלב מחומם אינו זמין.
- התבונן בדגימה עם עדשות אובייקטיביות בעוצמה נמוכה כדי לוודא שהיא שלמה ומוכנה להדמיה. לקבוע את מיקום הגידול בתוך הבאר.
- החלט כמה נקודות מדגם לקחת. בדרך כלל, 20 נקודות דגימה בכל באר, המפוזרות בטבעות קונצנטריות סביב הספרואיד יפיקו תוצאות מפורטות מספיק.
- הזז את הבמה לכל מיקום רצוי והשתמש בתוכנת התממשקות למיקרוסקופ כדי להקליט את קואורדינטות x ו- y (או להקליט קואורדינטות באופן ידני אם תוכנת התממשקות אינה זמינה).
- העבירו את המיקרוסקופ לעדשה אובייקטיבית עוצמתית (בדרך כלל 100X), ובחרו את קוביית המסנן המתאימה לאורך גל העירור של הגשושיות הנותבות. השתמש ברשימת הנקודות שנוצרו בשלב 2.4 כדי לעבור לנקודה הראשונה ברשת.
- כוונן את המיקוד כדי למצוא את תחתית הבאר, ולאחר מכן התקדם למעלה כדי למצוא שדה ראייה (fov) המכיל מספר גשושיות עוקבות ממוקדות.
- התבונן בהיסטוגרמה של העוצמה וכוונן את עוצמת החשיפה ואת זמן החשיפה כדי לספק את הטווח הדינמי הגדול ביותר האפשרי תוך הבטחה שהתמונה לא תהפוך רוויה.
- השג רצף וידאו בקצב פריימים של 20-30 msec למסגרת (מומלץ כ- 800 פריימים או אורך של 16-24 שניות כדי לספק נתונים סטטיסטיים מספיקים לחישוב MSD חזק המאוזן עם הצורך במזעור זמן הרכישה בכל נקודת רשת מרחבית) ושמור עם מוסכמה מתאימה. במהלך ההקלטה, אין לגעת במיקרוסקופ או בשולחן.
- חזור על שלבים 2.6 עד 2.9 לכל נקודת דגימה ברשת.
- חזור על שלבים 2.3 עד 2.10 עבור כל באר בניסוי.
