זיהוי ROS עם צביעת DCFH-DA: מדידת סך ROS בקווי תאים סרטניים במעי הגס

תקציר

מקור: Kim, H., et al. זיהוי של סך כל מיני החמצן הריאקטיבי בתאים דבקים על ידי צביעה של 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לזיהוי מיני חמצן תגובתי תאי כולל (ROS) באמצעות 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). שיטה זו מסייעת להמחיש לוקליזציה של ROS בתאים הדבקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולכמת עוד יותר את עוצמת ROS באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטיים.

פרוטוקול

1. זריעת תאים

1. זרע 2 x 10⁵ HCT116 תאי סרטן המעי הגס לכל באר בצלחת 24 בארות ולשמור על התאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) לילה ב 37 ° C.
2. החלף את מדיום התרבית עם או בלי 100 מיקרומטר ברזל סולפט (FS) או 10 מיקרומטר דוקסורוביצין (DOX) המכיל תווך ודגור במשך 24 שעות.

2. הכנת פתרון DCFH-DA

1. יש להמיס 4.85 מ"ג של DCFH-DA ב-1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ליצירת תמיסת מלאי של 10 מילימול.
2. דללו את תמיסת המלאי עם DMEM שחומם מראש לתמיסת עבודה של 10 מיקרומטר ממש לפני הוספתה לבארות.
3. וורטקס פתרון העבודה עבור 10 שניות.

3. צביעת DCFH-DA

1. הסר את המדיום המכיל תרופה ולשטוף פעם אחת עם DMEM.
2. הוסף 500 μL של פתרון העבודה DCFH-DA לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 30 דקות.
3. הסר את פתרון העבודה DCFH-DA. יש לשטוף פעם אחת עם DMEM ופעמיים עם 1x מלח חוצץ פוספט (PBS).
4. הוסף 500 μL של 1x PBS לכל באר.

4. רכישת הדמיה ומדידת עוצמה

1. צלם תמונות פלואורסצנטיות מייצגות עבור כל באר באמצעות תעלת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. לאחר צילום תמונות, הסר PBS והוסף 200 μL של מאגר משקעים רדיואימוניים (RIPA) לכל באר.
3. יש לדגור על קרח במשך 5 דקות, ולאחר מכן לאסוף ליזט תאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 21,130 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
5. מעבירים 100 μL של הסופרנאטנט לצלחת שחורה בעלת 96 בארות ומודדים את עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטיים באורך גל עירור של 485 ננומטר ובאורך גל פליטה של 530 ננומטר.
6. מעבירים 1 μL של הסופרנאטנט לצלחת שקופה בת 96 בארות המכילה 100 μL של תמיסת בדיקת חלבון 1x כדי למדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת ברדפורד.
7. לנרמל עוצמות פלואורסצנטיות עם ריכוזי חלבון.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical , אן ארבור, מישיגן	20656
דוקסורוביצין הידרוכלוריד	TCI אמריקה, פורטלנד, אורגון	D4193-25MG
מדיום הנשר המותאם של דולבקו	קורנינג, קורנינג, ניו יורק	45000-304
מערכת הדמיה אוטומטית Invitrogen EVOS FL	תרמו פישר סיינטיפיק וולת'ם, מסצ'וסטס	AMAFD1000	או כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי אחר
בדיקת חלבונים פתרון ברדפורד	Bio-Rad , הרקולס, קליפורניה	5000001
קורא Microplate SpectraMax M2	התקנים מולקולריים, Radnor, PA	89429-532	או כל קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי אחר
ברזל סולפט Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542