יצירת מודל עכבר PDOX של סרטן המעי הגס: חקר התקדמות סרטן המעי הגס במודל מורין

תקציר

מקור: Moret, R. et al. מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט הנגזרים מהמטופל עבור קרצינומה של תאי השתן האנושיים וצמיחת גידולים בסרטן המעי הגס והחלחולת וגרורות ספונטניות. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת מודל עכבר סרטן המעי הגס קסנוגרפט אורתוטופי הנגזר ממטופל כדי לחקור את התקדמות תאי סרטן המעי הגס בעכברים שאינם סובלים מהשמנת יתר/כשל חיסוני משולב חמור (NOD/SCID). מודל מורין זה מסייע בהבנת צמיחת הגידול הראשונית ותבנית גרורות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. תרבית קווי תאים

1. לגדל תאי HK במדיום RPMI-1640 מלא בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, גלוטמין 2 ננומטר, 100 U/מ"ל פניצילין G וסטרפטומיצין 100 מ"ג/מ"ל ב-37°C באינקובטור לח 5% CO₂.
   הערה: תאי HK הם תאים דנדריטיים פוליקולריים אנושיים רגילים וניתן לגדל ולהרחיב אותם במשך ≤ 15 מעברים במבחנה.

2. תיוג והעשרה של גידולים מסומנים בלוציפראז

1. השתלת גידולים ישירות באגף השמאלי והימני של עכברות NOD/SCID בנות 6-8 שבועות.
2. מדידת צמיחת הגידול דו-שבועית באמצעות קליפר דיגיטלי.
3. בקוטר 1 ס"מ, להמיר את הגידול. יש להזריק ישירות לגידול מנה אחת של חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP)-לנטיוירוס (50 μL/גידול, דילול 1:30 ממלאי מרוכז של טיטר לנטיוירוס) באמצעות מזרק 1 סמ"ק עם מחט 27 גרם.
   הערה: הגידול של המטופל מגיע בדרך כלל לקוטר של 1 ס"מ תוך 1-2 חודשים. עם זאת, קצב הגידול משתנה מאוד ומבוסס על מספר גורמים, כולל דרגת הגידול וסוגו.

3. דגם עכבר CRC

1. יש להרדים עכבר NOD/SCID זכר בן שישה עד שמונה שבועות עם איזופלורן (2.5% ב-100% חמצן, 1 ליטר/דקה) בתא הזירוז. אשר טשטוש עם צביטת בוהן.
2. הניחו את העכבר המורדם במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ מנתח, והקפידו להצמיד את חוטמו לקונוס אף איזופלורני ואת גפיו הקדמיות באמצעות סרט דבק ליציבות.
   הערה: ניתן להשתמש בזכוכית מגדלת במקום במיקרוסקופ מנתח. ניתן להשתמש בחפץ קטן כדי לשפר את הראות והזווית כאשר הוא ממוקם מתחת לבסיס הזנב, ומעלה את פי הטבעת. בדרך כלל, חלקים קטנים של גזה מגולגלים לתוך צורת גליל בקוטר 1 אינץ '.
3. מרחיבים את התעלה האנאלית בעזרת מלקחיים מעוקלים ומשומנים קהים כדי לחשוף את רירית פי הטבעת ופי הטבעת. הסר צואה.
4. השתמש במחט סטרילית נשלפת 30 G על מזרק זכוכית 50 μL כדי להזריק 10 μL של תאי גידול מתויגים luciferase ותאי HK (להשהות מחדש 10 μL של תאי גידול לכל עכבר עבור מודל CRC במדיה RPMI מלאה) לתוך תת רירית פי הטבעת האחורית הדיסטלית, 1 עד 2 מ"מ מעל התעלה האנאלית. שיפוע המחט צריך להיות מכוסה על ידי רירית. היזהרו לא לעבור לחלל האגן.
5. הסר את העכבר מחרוט האף איזופלורן. שימו לב אליו במשך שעה אחת לאחר ההליך. חפשו סימני מצוקה, כלומר גב כפוף, נשימה מאומצת וכו'.

4. הדמיה ביולומינסנטית

1. עקוב אחר העומס הגרורתי הראשוני של הגידול, הכבד והריאות מדי שבוע באמצעות מערכת הדמיה ביולומינסנטית לפעילות לוציפראז.
   1. קבל ניסוי CRC עכבר ולשקול. יש להזריק 150 מ"ג/ק"ג לוציפרין תוך צפקי ולהמתין 5 דקות עד שהמצע יזרום בגוף העכבר.
   2. מרדימים את העכבר עם 2.5% איזופלורן ב-100% חמצן, 1 ליטר/דקה בתא ההשראה.
   3. הכנס את העכבר למכשיר הדמיה BLI כאשר האף מקובע בחרוט האף. בעת חשיפה לתמונה, יש לוודא שאזור העניין פונה למצלמה. עבור הזרקת CRC, הצד הגחוני צריך לפנות למצלמה עבור כל תמונה. דמיינו את העכבר במצב שכיבה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI-1640 בינוני	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאי	110636
איזופלורן	הנרי שיין בריאות בעלי חיים	108333
די-לוציפרין (150 מ"ג/ק"ג)	פרקין אלמר	122796
גלוטמין (2 ננומטר)	פישר סיינטיפיק	35050061
Luc/RFP-lentivirus	ממשתפי הפעולה שלנו. ראה הערה 13: Gills, J. et al. מודל קסנוגרפט אורתוטופי הנגזר מהמטופל המאפשר קרצינומה של תאי דרכי השתן בדרגה גבוהה של השתלת גידול בשלפוחית השתן, גדילה, אנגיוגנזה וגרורות. אונקוטרגט. 9, 32718-32729, doi:10.18632/ oncotarget.26024 (2018).
פניצילין/סטרפטומיצין 100 מ"ל (100 U/מ"ל)	פישר סיינטיפיק	15140-122
גז
100% חמצן	איירגז בע"מ	OX USP200
100% CO2	איירגז בע"מ	CD USPE
עכברים
עכברי NOD/SCID בני 6-8 שבועות (נקבה)	מעבדת ג'קסון	1303
כלים
15 מ"ל צינור חרוטי	זארשטדט	11799
צלחת תרבית רקמות 150 מ"מ	ארה"ב סיינטיפיק בע"מ	CC7682-3614
מלקחיים	סימטריה כירורגית בע"מ	06-0011
מספריים כירורגיים	סימטריה כירורגית בע"מ	02--2011
ציוד
5% CO2 אינקובטור לח	תרמו סיינטיפיק	3110
מכונת הדמיה ביולומינסנטית (BLI)	פרקין אלמר	CLS136334
תוכנת מכונת הדמיה BLI	פרקין אלמר	CLS136335
קליפר דיגיטלי	פאולר כלים ומכשירים	54-115-330
מיקרוסקופ מנתח	Precision Instruments LLC	(504) 228-0076
תא אינדוקציה איזופלורן	פרקין אלמר	119038