$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת huA33-TCO
הערה: הסינתזה של huA33-TCO דווחה בעבר. עם זאת, כדי להקל על הקורא, הוא משוכפל כאן עם התאמות לתנאים אופטימליים.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל, הכינו תמיסה של 125 μL של (E)-cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS) בדימתילפורממיד יבש (DMF) בריכוז של 40 מ"ג/מ"ל (0.15 M). תמיסה זו יכולה להיות aliquoted ו קפוא ב -80 ° C לשימוש בניסויים עתידיים.
- בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.7 מ"ל, הכינו תמיסה של 5 מ"ג/מ"ל של huA33 ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS; 2.7 מ"מ אשלגן כלורי, 137 מ"מ נתרן כלורי ו-11.9 מ"מ אשלגן פוספט, pH 7.4).
- באמצעות aliquots קטנים (<5 μL) של 0.1 M Na2CO3, להתאים את ה- pH של תמיסת נוגדנים משלב 1.2 ל 8.8-9.0. השתמש בנייר pH או במד pH עם מיקרואלקטרודה כדי לפקח על ה- pH ולנקוט זהירות שה- pH אינו עולה על 9.0.
- לתמיסת הנוגדנים המתוארת בשלב 1.3, הוסף לאט נפח המתאים ל -40 מקבילות מולאריות של TCO-NHS ביחס לכמות הנוגדנים. לדוגמה, אם 5 מ"ג (30 nmol) של huA33 נמצא בתמיסה, הוסף 9.0 μL (1.20 μmol) של תמיסת 40 מ"ג/מ"ל (0.15 M) של TCO-NHS.
הערה: TCO-NHS הוא הידרופובי. בעת הוספתו לתמיסת הנוגדנים, מוסיפים אותו לאט ובתסיסה כדי למנוע משקעים. אין לחרוג מ-10% DMF לפי נפח בתמיסת התגובה הסופית.
- אפשר לתגובה לדגור ב 25 ° C על thermomixer במשך 1 שעה עם תסיסה קלה (500 סל"ד).
- לאחר שעה אחת, טהרו את ההצמדה החיסונית huA33-TCO באמצעות עמודת התפלת גודל חד פעמית ארוזה מראש.
- אזן את עמודת אי הכללת הגודל כמתואר על-ידי הספק כדי להסיר חומרים משמרים הנמצאים בעמודה במהלך האחסון. הליך טיפוסי כרוך בשטיפת העמודה 5x עם נפח PBS המתאים לנפח העמודה: 5 x 2.5 מ"ל של PBS.
- הוסף את תערובת התגובה לעמודת אי הכללת הגודל תוך ציון נפח תערובת התגובות.
- לאחר שתערובת התגובה נכנסה לעמודה, הוסף כמות מתאימה של PBS כדי להביא את נפח התמיסה הכולל שנוסף לעמודה עד 2.5 מ"ל. לדוגמה, אם תגובת הצמידות הביאה לנפח כולל של 1.3 מ"ל, הוסף 1.2 מ"ל PBS נוספים לעמודה.
- לאסוף את המוצר באמצעות 2 מ"ל של PBS כמו eluent.
הערה: שלב זה יניב את המבנה הסופי huA33-TCO ב 2 מ"ל של PBS, pH 7.4.
- מדוד את ריכוז ה- huA33-TCO באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis המנטר את אורך הגל של 280 ננומטר. מקדם ההכחדה המולרי עבור רוב IgGs (ε 280) הוא 210,000 M-1 cm-1.
- אם יש צורך בתמיסה עם ריכוז גבוה יותר של אימונו-מצומד, רכז את תמיסת huA33-TCO באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם חיתוך משקל מולקולרי של 50,000 בהתאם להוראות היצרן.
הערה: נוגדנים רבים ידועים כמצטברים או מזרזים במהלך הריכוז. כאשר מנסים הליך זה עם נוגדן חדש, החוקרים צריכים לדחות את הספרות או את הניסיון שלהם בטיפול בנוגדן המדובר.
- אחסנו את huA33-TCO immunoconjugate שהושלם בטמפרטורה של 4°C בחושך אם יש צורך בכך באופן מיידי. אם יש להשתמש בו יותר מ -4 ימים בעתיד, לאחסן אותו ב -80 °C בחושך.
הערה: זוהי נקודת עצירה מקובלת בהליך. huA33-TCO immunoconjugate שהושלם צריך להיות יציב לפחות 6 חודשים אחסון ב -80 ° C בחושך.
2. הסינתזה של Tz-PEG 7-NHBoc
- בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל, יש להמיס 5 מ"ג של אסטר טטרזין N-hydroxysuccinimidyl (Tz-NHS; 12.6 μmol) ב-0.15 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד נטול מים (DMSO).
- בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.7 מ"ל, יש להמיס 8 מ"ג של פולימר PEG אמינו מוגן בוק, O-(2-אמינואתיל)-O'-[2-(בוק-אמינו)אתיל]הקסאאתילן גליקול (NHBoc-PEG7-NH2; 17.1 μmol) ב-0.15 מ"ל של DMSO נטול מים.
- לתמיסה של Tz-NHS, להוסיף 3 μL (21.3 μmol, 1.7 שווה ערך מולרי) של triethylamine (TEA) ולערבב היטב.
- הוסף את תמיסת הטטרזין הוורודה לתמיסת NHBoc-PEG7-NH 2 משלב 2.2 ודגר על תערובת התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה קלה.
- לאחר 30 דקות, דללו את תערובת התגובה ביחס של 1:1 ב-H2O וטהרו אותה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים C18 (HPLC) הפוכה כדי להפריד כל Tz-NHS שלא הגיב לבין Tz-PEG 7-NHBoc. השתמש בממסים ללא חומצה כדי למנוע הסרה מוקדמת של קבוצת ההגנה של בוק. נטר הן את Tz-PEG 7-NHBoc והן את Tz-NHS באורך גל של 525 nm.
הערה: זמני השמירה תלויים מאוד בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודים, צינורות וכו '), ויש להפעיל בקרות מתאימות לפני הטיהור. עם זאת, כדי להציג דוגמה, אם נעשה שימוש בשיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם ללא כל תוספת) ל- 95:5 MeCN/H2O במשך 30 דקות, קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה, ועמודה אנליטית של 4.6 מ"מ x 250 מ"מ C18, זמני השמירה של Tz-NHS ו- Tz-PEG 7-NHBoc הם בסביבות 16 דקות ו- 18 דקות, בהתאמה.
- הקפיאו את חומר ה-HPLC שנאסף באמצעות חנקן נוזלי ועטפו את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום. הניחו את צינור האיסוף הקפוא על ליופיליזר למשך הלילה כדי להסיר את השלב הנייד של HPLC. המוצר יהיה אופייני ורוד בהיר מוצק.
הערה: אם חנקן נוזלי אינו זמין, יש להקפיא את חומר HPLC שנאסף בקרח יבש או למשך הלילה במקפיא של -80°C.
3. הסינתזה של Tz-PEG7-NH 2
- למוצר משלב 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, יש להוסיף 1.5 מ"ל של דיכלורומתאן (DCM) ולהעביר תמיסה זו לצלוחית קטנה בעלת תחתית עגולה.
- הוסף 0.25 מ"ל של חומצה טריפלואורואצטית (TFA) טיפתית לתמיסה הוורודה משלב 3.1.
- אפשר לתגובה לדגור במשך 30 דקות ב- RT עם תסיסה קלה.
- לאחר 30 דקות, לאדות את הממס באמצעות אידוי סיבובי. אין לחרוג מטמפרטורת אמבט המים של 37°C.
- לשחזר את המוצר צמיג ורוד ב 0.5 מ"ל של מים.
- לטהר את המוצר באמצעות שלב הפוך C18 HPLC כדי להפריד את Tz-PEG7-NH 2 מקודמן המוגן באמצעות Boc. נטר הן את Tz-PEG 7-NHBoc והן את Tz-PEG 7-NH 2 באורך גל של 525 nm.
הערה: זמני השמירה תלויים מאוד בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודים, צינורות וכו '), ויש להפעיל בקרות מתאימות לפני הטיהור. עם זאת, כדי להציג דוגמה, אם נעשה שימוש בשיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) ל- 95:5 MeCN/H2O במשך 30 דקות, קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה, וטור אנליטי של 4.6 מ"מ x 250 מ"מ C18, זמני השמירה של Tz-PEG 7-NHBoc ו- Tz-PEG 7-NH 2 הם בסביבות 18 דקות ו- 13 דקות, בהתאמה.
- הקפיאו את חומר ה-HPLC שנאסף באמצעות חנקן נוזלי ועטפו את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום. הניחו את צינור האיסוף הקפוא על ליופיליזר למשך הלילה כדי להסיר את השלב הנייד של HPLC. המוצר יהיה מוצק ורוד בהיר.
- לבנות מחדש את המוצר משלב 3.7, Tz-PEG7-NH 2, עם 150 μL של DMSO ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל.
- מדוד את הריכוז של Tz-PEG7-NH 2 באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis המנטר את אורך הגל של 525 ננומטר. מקדם ההכחדה המולרי עבור Tz-PEG7-NH 2 (ε525) הוא 535 M-1 cm-1.
4. הסינתזה של Tz-PEG7-DOTA
- יש להמיס את Tz-PEG7-NH 2 (4.5 מ"ג, 6.9 מיקרומול) ב-0.15 מ"ל DMSO (או להמשיך בתמיסה שנוצרה בשלב 3.8).
- הוסף 22 שווה ערך מולארי של TEA (21 μL, 0.15 mmol ) לתמיסה המכילה טטרזין משלב 4.1.
- מוסיפים 10 מ"ג (14.2 μmol) של p-SCN-Bn-DOTA כמוצק ומערבלים את התמיסה למשך כ-2 דקות או עד להמסת החומר במלואו.
- אפשר לתגובה לדגור במשך 30 דקות ב- RT עם תסיסה קלה.
- לאחר 30 דקות, לדלל את התגובה 1:1 ב- H2O ולטהר את המוצר באמצעות שלב הפוך C18 HPLC כדי להסיר p-SCN-Bn-DOTA שלא הגיב. ניתן לנטר את p-SCN-Bn-DOTA באורך גל של 254 ננומטר, בעוד ש- Tz-PEG7-DOTA מנוטר בצורה הטובה ביותר באורך גל של 525 ננומטר.
הערה: זמני השמירה תלויים כמובן מאוד בציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודים, צינורות וכו '), ויש להפעיל בקרות מתאימות לפני הטיהור. עם זאת, כדי להציג דוגמה, אם נעשה שימוש בשיפוע של 5:95 MeCN/H2O (שניהם עם 0.1% TFA) ל- 95:5 MeCN/H2O במשך 30 דקות ועמודה אנליטית של 4.6 x 250 מ"מ C18, ל- Tz-PEG7-DOTA ו- p-SCN-Bn-DOTA יש זמני שמירה של כ- 15.6 דקות ו- 16.1 דקות, בהתאמה.
- הקפיאו את חומר ה-HPLC שנאסף באמצעות חנקן נוזלי ועטפו את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום. הניחו את צינור האיסוף הקפוא על ליופיליזר למשך הלילה כדי להסיר את השלב הנייד של HPLC. המוצר יהיה אבקה ורודה בהירה.
- לבנות מחדש את המוצר ב 0.15 מ"ל של DMSO ולמדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis ניטור אורך גל 525 ננומטר. מקדם ההכחדה המולרי עבור Tz-PEG 7-DOTA (ε525) הוא 535 M-1 cm-1.
- נתח את התרכובת הסופית באמצעות תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRMS) כדי לוודא שהסינתזה הצליחה. ראו טבלה 1 לגבי השינויים הכימיים והמשקלים המולקולריים שנקבעו בניסוי של כל התרכובות שנדונו בעבודה זו.
- אחסן את תמיסת Tz-PEG7-DOTA המטוהרת בחושך בטמפרטורה של -80°C.
הערה: זוהי נקודת עצירה מקובלת בהליך. קודמן Tz-PEG7-DOTA שהושלם יציב למשך שנה לפחות בתנאים אלה.
5. 177Lu Radiolabeling of Tz-PEG7-DOTA
זהירות: שלב זה של הפרוטוקול כולל טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע שלבים אלה - או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות - החוקרים צריכים להתייעץ עם מחלקת בטיחות קרינה של המוסד הביתי שלהם. לנקוט בכל הצעדים האפשריים כדי למזער את החשיפה לקרינה מייננת.
הערה: בעת עבודה עם כמויות קטנות של מתכות רדיו, מומלץ שכל המאגרים יהיו נקיים ממתכות קורט כדי למנוע הפרעה בקשירת אתר התיאום.
- בצינור צנטריפוגה של 1.7 מ"ל, הוסף 200 μL של חיץ אמוניום אצטט 0.25 M מותאם עם aliquots של 1 M HCl ל- pH 5.5.
הערה: אם משתמשים בפחות מ- 370 MBq של פעילות עבור התוויה, יש להפחית את נפח המאגר המשמש ל- 100 μL.
- הוסף את הכמות הרצויה של [177Lu]LuCl3 לתמיסת המאגר. הכמות שתתווסף תהיה תלויה במספר הנבדקים בניסוי ובמינונים הרדיואקטיביים הניתנים. מומלץ להוסיף 1-2 מנות נוספות של רדיואקטיביות כאמצעי זהירות כדי לפצות על אובדן פוטנציאלי של רדיואקטיביות במהלך שלבי הטיהור.
- הוסף Tz-PEG7-DOTA ב-DMSO לתערובת הרדיואקטיבית בשלב 5.2. כמות Tz-PEG 7-DOTA תלויה במספר הנבדקים. פרטים נוספים בנושא זה ניתן למצוא בשלב 6.2.2.2.
- אפשר לתמיסה לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות.
- ודא שתיוג הרדיו הושלם באמצעות כרומטוגרפיית שכבה דקה מיידית של רדיו (radio-iTLC) עם 50 mM EDTA, pH 5.5 כשלב הנייד. המסומן [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz יישאר בקו הבסיס — Rf = 0 — בעוד שחופשי [177Lu]Lu3+ יתואם על ידי EDTA וינוע עם חזית הממס, Rf = 1.0 (איור 1B).
- אם לא הושגה תיוג כמותי, הוסיפו ליגנדות כדי לתאם את הרדיו-מתכת החופשית. לחלופין, טהרו את התווית [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz באמצעות מחסנית C18. בצע את הוראות היצרן לשימוש. הליך לדוגמה מובא להלן.
- הפעל את המחסנית על ידי העברה איטית של 5 מ"ל אתנול דרך המחסנית עם מזרק גדול. לאחר מכן, לעבור דרך 5 מ"ל של acetonitrile ולאחר מכן 5 מ"ל של deionized (DI) H2O.
- צייר את תמיסת הרדיוליגנד משלב 5.3 במזרק קטן יותר והזריק אותה באיטיות למחסנית C18. לאחר מכן, שטוף את המחסנית עם 10 מ"ל של DI H2O כדי להסיר כל מאוגד [177Lu]LuCl3.
- Elute עם 500 μL של אתנול. הסר כל אתנול מהמוצר הסופי על ידי העברת הכלי עם קצב זרימה נמוך של חנקן יבש או ארגון למשך 10-15 דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את הרדיוליגנד במי מלח בנפח שנקבע בשלב 6.2.2.2.
6. מחקרי In vivo
זהירות: כמו בסעיף 5, שלב זה של הפרוטוקול כרוך בטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע שלבים אלה, על החוקרים להתייעץ עם מחלקת בטיחות הקרינה של מוסד הבית שלהם. לנקוט בכל הצעדים האפשריים כדי למזער את החשיפה לקרינה מייננת.
- הכנת בעלי חיים
- בנקבות עכברים עירומים אתימיים, שותלים תת-עורית 5 x 106 SW1222 תאי סרטן המעי הגס המרחפים ב-150 מיקרוליטר של תערובת 1:1 של מדיה תאית ומטריקס (למשל, מטריג'ל) ומאפשרים להם לגדול ל-100-150 מ"מ3 קסנוגרפט (14-18 ימים לאחר החיסון).
- מיון בעלי חיים לניסוי הפצה ביולוגית
- ברגע שהגידולים הם בגודל מספיק כפי שנקבע על ידי מדידת קליפר, מיין את בעלי החיים כדי לוודא שלכל קבוצה יש בערך את אותו נפח גידול ממוצע. ניתן להבחין בין בעלי החיים בכל כלוב על ידי סימונים על הזנב בדיו בל יימחה (רצועה אחת, שתי רצועות וכו ').
- מיון בעלי חיים למחקר טיפול אורכי
- ברגע שהגידולים הם בגודל מספיק כפי שנקבע על ידי מדידת קליפר, הצמידו תגי אוזניים לכל אחד מבעלי החיים כדי להבטיח מעקב נכון לאורך כל הניסוי.
הערה: תגי אוזניים מספריים עלולים ליפול במהלך הניסוי. כתוצאה מכך, מומלץ ללוות תגים פיזיים אלה עם חריצים באוזן באופן שיטתי (כלומר, ימין, שמאל, דו צדדי, ימין x 2, שמאל x 2).
- מיין את בעלי החיים כך שנפח הגידול הממוצע בכל קבוצה יהיה שווה פחות או יותר. השיטה הבאה למיון בעלי חיים יכולה להתבצע באמצעות תוכנית גיליון אלקטרוני.
- רשום את מספרי הזיהוי של בעלי החיים, תבנית חריץ האוזן ונפח הגידול בשלוש עמודות נפרדות.
- מיין את הנתונים מנפח הגידול הקטן ביותר לגדול ביותר.
- בטור רביעי, הקצו לכל חיה מספר כלוב ועברו בין הכלובים בתבנית דמוית נחש. לדוגמה, אם יש 5 כלובים, עמודה זו תתמלא "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 2, 3, 4, 5..." עד שכל החיות יוקצו לכלוב.
- לאחר הקצאת הכלובים, מיין את הנתונים לפי מספר הכלוב. אם משתמשים בחריצי אוזניים, ודאו שלכל בעל חיים בכלוב נתון יש תבנית חריץ אוזן ייחודית. אם יש כפילויות (שתיים או יותר מאותה תבנית) בכלוב נתון, החליפו עכבר אחד עם עכבר אחד מכלוב אחר בתבנית החסרה עד שבכל כלוב יהיו בעלי חיים עם דפוסי חריץ אוזניים ייחודיים.
- פורמולציות וזריקות
הערה: רצף ההזרקה הן להפצה ביולוגית והן למחקר הטיפול ממשיך כדלקמן: huA33-TCO מוזרק ראשון, ואחריו [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz לאחר מרווח זמן שנקבע מראש.
- Immunoconjugate
- יש לדלל אליציטוט של תמיסת huA33-TCO משלב 1.9 לריכוז של 0.8 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים 0.9%.
- יש לשאוב מינונים של 150 μL (100 מיקרוגרם) של תמיסת huA33-TCO במזרקים שטופלו באלבומין 1% בסרום בקר (BSA) ב-PBS ולאחסן מזרקים אלה על ice.
הערה: טיפול BSA מפחית את הקשירה הלא ספציפית של הנוגדן לדפנות המזרק.
- מחממים את החיה תחת מנורת חום במשך 3 דקות כדי להרחיב את וריד הזנב.
- הזריקו את תמיסת huA33-TCO לווריד הזנב של העכבר נושא הקסנוגרפט. אפשר 24 שעות (או מרווח זמן שונה שנקבע מראש) עבור huA33-TCO להצטבר בגידול של העכבר.
- רדיוליגנד
- Radiolabel Tz-PEG7-DOTA כמפורט בסעיף 5.
- יש ליטול מינונים של 150 μL של 0.9% מלוחים סטריליים המכילים 1.1 מקבילות טוחנות של Tz-PEG7-DOTA ביחס לכמות huA33-TCO שניתנה. לדוגמה, אם 100 מיקרוגרם (0.67 nmol) של huA33-TCO הוזרק לחיה ותערובת התגובה [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz יוצרה עם פעילות ספציפית של 12.4 GBq/μmol, אז יילקחו מנות המכילות 9.14 MBq של פעילות כל אחת. זה מתאים 0.74 nmol של Tz (1.1 eq. טוחנת ביחס huA33-TCO).
- חממו את בעלי החיים תחת מנורת חום למשך 3 דקות כדי להרחיב את וריד הזנב.
- להזריק את המינון של רדיוליגנד לתוך וריד הזנב של העכבר נושא xenograft. כמות הפעילות שיש להזריק נקבעת על ידי החוקר. נתונים שפורסמו הראו השפעות טיפוליות תלויות מינון על גודל הגידול בטווח של 7.4 - 55.5 MBq.
