מיצוי miRNA במחזור: שיטה לבידוד miRNA מדגימות פלזמה באמצעות מיצוי אורגני והעשרת RNA קטנה

Abstract

מקור: Canale, M. et al., זיהוי פאנל מותאם אישית של מיקרו-רנ"א במחזור בחולים עם סרטן מעי גס גרורתי. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר מיצוי מיקרו-רנ"א במחזור הדם מדגימות פלזמה של חולי סרטן המעי הגס באמצעות מיצוי אורגני ואחריו העשרת עמודי זכוכית. miRNAs יציבים בנוזלים ביולוגיים כגון סרום ופלזמה, מה שהופך אותם לסמנים ביולוגיים אידיאליים במחזור הדם לאבחון סרטן, פרוגנוזה וקבלת החלטות טיפול וניטור. שיטה זו תסייע לזהות סמנים ביולוגיים חדשים במחזור המסוגלים לחזות תוצאות קליניות בחולים.

Protocol

הערה: בצע את כל השלבים הבאים תחת מכסה אדים מעוקר בהתאם ל- Good Laboratory Practice (GLP).

1. איסוף ואחסון פלזמה

1. אסוף 3 מ"ל של דגימת דם היקפית בצינור K3E EDTA.
2. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורת החדר ב 1,880 x גרם במשך 15 דקות.
3. לשחזר את פלזמה supernatant ב aliquots של 450 μL.
4. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.
   הערה: יש לעבד את צינור הדם ההיקפי תוך שעתיים מרגע האיסוף. בעת שחזור הפלזמה מן הצינור, לא להפריע שכבת הלימפוציטים.

2. מיצוי miRNA במחזור הדם מדגימות פלזמה

1. הכינו את כל התמיסות הנדרשות והפשירו את הדגימות לשלבי המיצוי.
   1. הוסף 375 μL של 2-mercaptoethanol לתמיסת דנטורינג 2x ומערבבים היטב.
   2. הוסף 21 מ"ל אתנול 100% בדרגת ACS לתמיסת השטיפה miRNA I וערבב היטב.
   3. הוסף 40 מ"ל של אתנול 100% בדרגת ACS לתמיסת הכביסה 2/3 וערבב היטב.
   4. אפשר aliquot פלזמה להפשיר בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להתחיל את שלבי החילוץ.

2. מיצוי אורגני
   1. העבר 400 μL של דגימת פלזמה לתוך צינור 2 מ"ל ללא RNase.
   2. מוסיפים 400 μL של תמיסת דנטורינג 2x, מערבבים על ידי מערבולות וצנטריפוגה קצרה.
   3. מוסיפים 4 μL של ספייק-אין 1 ננומטר, מערבבים על ידי מערבולות וצנטריפוגה קצרה.
   4. הוסף 800 μL של חומצה פנול-כלורופורם.
   5. מערבולת למשך 60 שניות וצנטריפוגה במהירות מרבית (≥10,000 x גרם) למשך 15 דקות.
   6. מעבירים את הפאזה המימית העליונה לצינור טרי. אל תפריעו לשלב הביניים. שים לב לנפח המשוחזר והשלך את הצינור המכיל את הפאזה הלא מימית.
      הערה: תמיסת הדנטורינג 2x מאוחסנת ב -4 ° C ועשויה להתמצק בטמפרטורה זו. לפני השימוש, לחמם את התמיסה ל 37 ° C, מדי פעם תוסס במשך 10-15 דקות. היזהרו למשוך את השלב התחתון המכיל את החומצה פנול-כלורופורם, ולא את החיץ המימי שנמצא על גבי התערובת. מחממים מראש את תמיסת האלוציה או מים נטולי נוקלאז ל-95°C. יש להקפיד לחמם כמות מספקת של תמיסה (100 מיקרוליטר לדגימה + 10% עודף).

3. העשרת RNA קטנה
   1. מוסיפים 1/3 נפח אתנול 100% לשלב המימי משלב 2.2.6 ומערבבים היטב.
   2. הכנס מחסנית מסנן לצינור איסוף טרי עבור כל דגימה.
   3. העבר עד 700 μL של ליזט משלב 2.3.1 ואתנול למחסנית המסנן ולצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות.
   4. אם נותרו >700 מיקרוליטר של תערובת, הניחו את התסנין בצינור טרי וחזרו על שלב 2.3.3; חזרו על הפעולה עד שכל התערובת תעבור דרך מחסנית המסנן.
   5. מדוד את הנפח הכולל של הזרימה.
   6. מוסיפים 2/3 נפח אתנול 100% לסינון ומערבבים היטב.
   7. הניחו מחסנית מסנן שנייה בצינור איסוף חדש.
   8. העבר עד 700 μL מנפח הדגימה למחסנית ולצנטריפוגה במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות. מחק את הזרימה.
   9. חזור על שלב 1.3.8 עד שכל התערובת תעבור דרך מחסנית המסנן.
   10. יש למרוח 700 μL של תמיסת שטיפת miRNA 1 על מחסנית המסנן ולבצע צנטריפוגות של מחסנית המסנן עם צינור האיסוף במהירות של 10,000 x גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הזרימה. הניחו את מחסנית המסנן באותו צינור איסוף.
   11. יש למרוח 500 מיקרוליטר של תמיסת כביסה 2/3 על מחסנית המסנן ולצנטריפולג את מחסנית המסנן עם צינור האיסוף במהירות של 10,000 x גרם למשך 15 שניות. יש להשליך את הזרימה. הניחו את מחסנית המסנן בצינור איסוף חדש.
   12. הנח את מחסנית המסנן בצינור איסוף טרי וחזור על שלב 2.3.11 עם 500 μL של תמיסת כביסה 2/3. השליכו את הזרימה והעבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש.
   13. צנטריפוגו את הצינורות עם מחסניות המסנן במהירות של 10,000 x גרם למשך דקה אחת.
   14. העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף טרי של 1.5 מ"ל והוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת אלוציה שחוממה מראש (95 ° C) או מים ללא נוקלאז.
   15. צנטריפוגה בטמפרטורה של 10,000 x גרם למשך 30 שניות לשחזור miRNA ואחסון בטמפרטורה של -80°C.
       הערה: משקע לבן עשוי להיווצר בתמיסת הכביסה 2/3. משקע זה הוא עודף EDTA המשתחרר מהפתרון. הימנעו מציור גבישים אלה במהלך שלבי הצנרת.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינורות 1.5 מ"ל ללא מנעול בטוח ללא Rnase	אפנדורף	0030 123.328
1000 μL טיפים ללא Rnase	סטארלאב	S1122-1830
נעילה בטוחה ללא רנאז 2 צינורות מ"ל	אפנדורף	0030 123.344
ללא רנאז 20 טיפים μL	סטארלאב	S1123-1810
200 μL טיפים ללא Rnase	סטארלאב	S1120-8810
mirVana PARIS RNA וערכת טיהור חלבונים טבעית	תרמו פישר	AM1556
100% אתנול anidrous ACS כיתה	ריאגנטים קרלו ארבה	414605
2-מרקפטו-אתנול	סיגמא-אולדריץ'	M3148
0.2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 מיקרוליטר פיפטות מעבדה
מכסה אדים
מיקרוצנטריפוגה Benchtop
מערבולת