$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד DNA גנומי מהצואה
הערה: השתמש בערכה מסחרית כדי לבודד דנ"א מיקרוביאלי מצואה בהתאם לפרוטוקול זיהוי פתוגן בצואה. הוציאו את הדגימות ישירות מהמקפיא בטמפרטורה של -80°C ואחסנו על קרח יבש בזמן השקילה.
- יש להעביר עד 220 מ"ג צואה לצינור מיקרופוגה נקי המכיל 1.4 מ"ל של חיץ ליזיס צואה בטמפרטורת החדר (RT) (ראו טבלת חומרים).
- דגימת מערבולת במשך דקה אחת כדי ליצור הומוגניות יסודית של מוצקים (איור 1B). מחממים את התרחיף ל-95°C למשך 5 דקות כדי ללדת את כל החיידקים (כולל חיידקים גראם-חיוביים).
- מערבולת דוגמת במשך 15 שניות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך דקה אחת כדי לזרוק את מוצקי הצואה. מעבירים סופרנאטנט לצינור מיקרופוגה בנפח 2 מ"ל. הוסף טבליה אחת לכל דגימה כדי לספוג מעכבי PCR, מערבל עד להמסת הטבליה, ודגור על הדגימה ב- RT למשך דקה אחת.
- צנטריפוגה את הדגימה ב 20,000 x גרם במשך 3 דקות ולהעביר את supernatant לצינור microfuge חדש. צנטריפוגה ב 20,000 x גרם במשך 3 דקות. Aliquot 15 μL של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל מלאי) לתוך צינור מיקרופוגה חדש 1.5 מ"ל. פיפטה 200 μL של הדגימה לתוך הצינור המכיל proteinase K.
- הוסף 200 μL של חיץ ליזה גואנידיניום כלוריד לצינור, מערבל היטב במשך 15 שניות (ראה טבלת חומרים) ודגר על הדגימה ב 70 ° C במשך 10 דקות. הוסף 200 μL של אתנול (96-100%) לצינורות וערבב היטב על ידי מערבולת.
- מניחים עמודת ספין מבוססת סיליקה בצינור איסוף של 2 מ"ל והחילו את הדגימות על העמודה. סגור את המכסה והצנטריפוגה למשך דקה אחת במהירות של 20,000 x גרם.
- מעבירים את העמוד לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל ומוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה 1 לעמודה, מכסים את העמוד והצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-20,000 x גרם. מעבירים את העמוד לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל ומוסיפים 500 מיקרוליטר של חיץ כביסה 2 לעמודה, סוגרים את הפקק וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 3 דקות.
- כאשר המכסה סגור, העבר את העמוד לצינור איסוף חדש של 2 מ"ל, וצנטריפוגה למשך דקה אחת נוספת במהירות של 20,000 x גרם כדי להסיר את מאגר השטיפה השיורי. העבירו את העמודה לצינור מיקרופוגה בעל תווית של 1.5 מ"ל והדליקו את הדגימה על ידי הוספת 200 μL של חיץ אלוציה המכיל EDTA לממברנה (ראו טבלת חומרים).
- סגור את הפקק ודגור ב- RT למשך דקה אחת. צנטריפוגה את הדגימה למשך דקה אחת ב- 20,000 x גרם. מחק את העמודה.
2. קביעת ריכוז DNA והכנת דגימות ל-PCR
הערה: השתמש בפלואורומטר ובבדיקת dsDNA פלואורסצנטית זמינה מסחרית כדי לקבוע את ריכוז הדנ"א הגנומי בכל דגימה (ראה טבלת חומרים). הצבע הפלואורסצנטי חייב לקשור דנ"א דו-גדילי באופן ספציפי.
- הכינו דילול בקנ"מ 1:200 של כל דגימה (1 מיקרוליטר מכל דגימה בתערובת מאסטר של 199 μL dsDNA) ודילול של 1:50 תקנים. נתח על פלואורומטר באמצעות הגדרת dsDNA.
הערה: נפח גבוה של DNA ב- PCR יכול להיות מעכב, לכן, נפח ה- DNA המשמש לא חייב להיות יותר מ -10% מהנפח הסופי של ה- PCR. פלואורומטר מאפשר מדידה מדויקת של הדנ"א בדגימה, שכן רק דנ"א הקשור לצבע הפלואורסצנטי יפלוט, ובכך יבטל את התרומה האפשרית של מזהמים לריכוז הדנ"א המחושב הסופי. רמה זו של כימות מדויק חיונית ליישום הרצף במורד הזרם.
- הכן תבניות PCR מדוללות ל -5 ננוגרם/μL עם הנפח המתאים של 10 mM Tris, pH 8.5 כדי ליצור מלאי תבניות עבודה של כל דגימה.
- יש לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -20°C.
3. עיצוב פריימרים לאזורי V הרצויים של 16S
- תכננו פריימרים כדי להגביר באופן סלקטיבי את אזורי ה-rRNA הרצויים של V 16S.
- נתח פריימרים עם Probe Match, מתוך פרויקט מסד הנתונים הריבוזומלי, כדי לקבוע את שיעור הפגיעה המשוער עבור phyla.
שונים
הערה: עבור אזורי V1-V3, המחקר הנוכחי השתמש בפריימרים שפורסמו Bosshard forward, אשר נקשרים במיקום 8 בתוך אזור V1, ו-533 הפוך, אשר נקשר במיקום 533 בתוך אזור V3. פריימרים חייבים לכלול רצפי מתאמי תליה לצורך יצירת אינדקס.
- בעת תכנון פריימרים, כלול רצפי מתאמים בקצוות 5' של כל פריימר, כפי שמומלץ להכנת ספריית ריצוף מטאגנומי 16S (טבלה 1).
- סנתז פריימרים גדולים אלה עם טיהור מחסניות. לבנות מחדש פריימרים מיובשים ולדלל מלאי עבודה PCR ל 1 מיקרומטר ב 10 mM Tris, pH 8.5.
4. Amplicon PCR להגברת אזורי V עם רצפי מתאם Overhang מחוברים
- הגדר את תערובת תגובת ה- PCR של אמפליקון כמתואר בטבלה 2.
- הניחו חותם לוחית PCR שקוף דביק על הצלחת והריצו את האמפליקון PCR באמצעות הפרמטרים בטבלה 3.
- (אופציונלי) הפעל מוצרי אמפליקון PCR על ג'ל אגרוז או בדיקת DNA ברגישות גבוהה המאפשרת מדידה כמותית של גודל האמפליקון (ראה טבלת חומרים).
הערה: גודל האמפליקון ממחקר זה הוא 550 bp (איור 2a).
5. ניקוי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים
- צנטריפוגו את צלחת ה-PCR האמפליקון במהירות של 1,000 x גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף עיבוי.
הערה: ניתן להשתמש ברצועות צינור PCR במקום צלחות PCR כדי למזער את הזיהום. יש להשליך את מכסי הצינור ולעולם לא לעשות בהם שימוש חוזר.
- מערבלים את החרוזים המגנטיים כדי לפזר אותם באופן שווה ומוסיפים 20 μL של חרוזים מגנטיים לכל אמפליקון PCR היטב, ואז פיפטה את כל נפח למעלה ולמטה לאט 10 פעמים.
- יש לדגור ב-RT למשך 5 דקות. מניחים את לוחית ה-PCR על מעמד מגנטי למשך 2 דקות עד שנאספים חרוזים מגנטיים והסופרנאטנט צלול. הסר והשליך את הסופר-נטנט.
- שטפו חרוזים עם 200 μL אתנול טרי 80% בזמן שצלחת ה-PCR נמצאת על המעמד המגנטי ודגרו במשך 30 שניות ב-RT על המעמד המגנטי. בזהירות להסיר את supernatant.
- חזרו על הכביסה פעם נוספת. כעת, השתמשו בקצה פיפטה דק כדי להסיר שאריות אתנול מהבארות ולאפשר ייבוש באוויר למשך 10 דקות.
- הסר את לוחית ה-PCR מהמעמד המגנטי והוסף 52.5 μL של 10 mM Tris pH 8.5 לכל באר. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להשהות חרוזים ולדגור בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות.
- העבירו את לוחית ה-PCR למעמד המגנטי כדי לאסוף חרוזים מגנטיים והעבירו 50 מיקרוליטר של הסופרנאטנט לצלחת PCR נקייה. הניחו אטם צלחת PCR שקוף דביק על הצלחת ואחסנו בטמפרטורה של -20°C למשך עד שבוע.
| Amplicon PCR פריימרים |
| קדימה | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| הפוך | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| רצפים ספציפיים של לוקוס מוצגים בגופן מודגש והלא מודגש הוא רצף מתאם התלייה. |
טבלה 1: פריימרים ל-Amplicon PCR.
| הגדרת תגובת Amplicon PCR | |
| נפח |
| דנ"א מיקרוביאלי (5ng/μl) | 2.5 מיקרוליטר |
| פריימר קדמי (1 מיקרומטר; משלב 3.1) | 5.0 μl |
| פריימר הפוך (1 מיקרומטר; משלב 3.1) | 5.0 μl |
| 2X תערובת מוכנה ל-HotStart | 12.5 מיקרוליטר |
| סך | 25.0 מיקרוליטר |
טבלה 2: פריימרים ל-Amplicon PCR.
| Amplicon PCR להגדיר |
| 95°C למשך 3 דקות | |
| 25 מחזורים של: | |
| 95°C למשך 30 שניות |
| 55°C למשך 30 שניות |
| 72°C למשך 60 שניות |
| 72°C למשך 3 דקות | |
| החזק בטמפרטורה של 4°C | |
טבלה 3: הגדרת תוכנית Amplicon PCR.
