CRC Organoid Cell Labeling: שיטה ליצירת תאי אורגנואיד של סרטן המעי הגס GFP Lentivirus

תקציר

מקור: Okazawa Y. et al., זיהוי רגישות גבוהה של מיקרוגרורות שנוצרו על ידי GFP אורגנואידים מותמרים Lentivirus בתרבית מגידול המעי הגס שמקורו בחולה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת אורגנואידים CRC המומרים על ידי חלקיקים לנטי-ויראליים של GFP המאפשרים הדמיה פלואורסצנטית. אורגנואידים אלה המסומנים ב-GFP, כאשר הם ממוקמים במודלים של בעלי חיים, מסייעים לחקור פלישה וגרורות של גידולים.

פרוטוקול

1. יצירת אורגנואידים CRC בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותית

הליכים ניסיוניים עבור תרבית אורגנואיד CRC של PDX המעי הגס מתוארים באיור 1B (שלב 4).

1. להקים מדיום תרבית המתאים לאורגנואידי CRC שמקורם ב-PDX (ראו טבלת חומרים, "מדיום תרבית האורגנואידים CRC") תוך שימוש במדיה שתוארה קודם לכן עבור אורגנואידים אנושיים של המעי הגס.
2. יש למרוח 150 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ראו טבלת חומרים) לכל באר על צלחת של 12 בארות על קרח ולאחר מכן לדגור עליה במשך 30-60 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ כדי למצק את הג'לים.
3. השהה את גלולת התא של תאי CRC המתקבלת מ....

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של יצירת גרורות על-ידי אורגנואידי CRC שמקורם ב-PDX המסומנים ב-GFP lentivirus בעכברי NOG.(A) השתלת חתיכות קטנות של רקמת CRC באופן תת-עורי בעכברי NOG (שלב 1). רקמת ה-CRC שנותחה בניתוח מהמטופל נחתכה לחתיכות והושתלה תת-עורית בעכברי NOG. S.C.: השתלה תת עורית. (B) יצירת אורגנואידים CRC מנותקים מ-PDX (שלב 2-4). קסנוגרפטים CRC שפותחו נטחנו (של.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 12 בארות	BMBio	#92412
מיקרו-צינור	אפנדורף	#0030120086	אוטוקלאבה לפני השימוש
המוציטומטר	ארמה	#03-202-1
מטריצת קרום מרתף מטריגל	קורנינג	#354234	יש לאחסן את ה-aliquots בטמפרטורה של -20°C. מניחים על קרח עד לשימוש
קולגנאז סוג 1	סיגמא	#C1030	150 מ"ג/מ"ל Collagenase Type1 ב-1×PBS. יש לאחסן aliquots בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה
DMEM/F-12 עם GlutaMAX™	גיבקו	#10565018
פניצילין	גיבקו	#15140122	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לשימוש תוך חודש
hEGF	פפרוטק	#AF-100-15	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להוסיף למוצר בינוני ביום השימוש
Y27632, מעכב ROCK	וואקו	#253-00591	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להוסיף למוצר בינוני ביום השימוש
סטרפטומיצין	גיבקו	#15140122	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לשימוש תוך חודש
מדיום תרבית אורגנואידים CRC עם 1% או 5% FCS			DMEM/F-12 עם תוסף GlutaMAX™ (Gibco #10565018) בתוספת FCS של 1% או 5%, 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 נ"ג/מ"ל hEGF ו-10 μM Y27632, מעכב ROCK. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש להשתמש תוך חודש.
וקטור PRRL-GFP	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
יורש העצר של FuGENE 6 transfection	רוש	11814 443001
pCMV-VSV-G	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
pCMV-dR8.2 DVPR	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
מיקרוסקופ Zeiss Axioplan 2 סטריאופלואורסצנטי	זיס