CRC Organoid Cell Labeling: שיטה ליצירת תאי אורגנואיד של סרטן המעי הגס GFP Lentivirus

תקציר

מקור: Okazawa Y. et al., זיהוי רגישות גבוהה של מיקרוגרורות שנוצרו על ידי GFP אורגנואידים מותמרים Lentivirus בתרבית מגידול המעי הגס שמקורו בחולה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת אורגנואידים CRC המומרים על ידי חלקיקים לנטי-ויראליים של GFP המאפשרים הדמיה פלואורסצנטית. אורגנואידים אלה המסומנים ב-GFP, כאשר הם ממוקמים במודלים של בעלי חיים, מסייעים לחקור פלישה וגרורות של גידולים.

פרוטוקול

1. יצירת אורגנואידים CRC בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותית

הליכים ניסיוניים עבור תרבית אורגנואיד CRC של PDX המעי הגס מתוארים באיור 1B (שלב 4).

1. להקים מדיום תרבית המתאים לאורגנואידי CRC שמקורם ב-PDX (ראו טבלת חומרים, "מדיום תרבית האורגנואידים CRC") תוך שימוש במדיה שתוארה קודם לכן עבור אורגנואידים אנושיים של המעי הגס.
2. יש למרוח 150 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ראו טבלת חומרים) לכל באר על צלחת של 12 בארות על קרח ולאחר מכן לדגור עליה במשך 30-60 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ כדי למצק את הג'לים.
3. השהה את גלולת התא של תאי CRC המתקבלת ממודל העכבר PDX עם מדיום תרבית האורגנואידים CRC (משלב 1.1) עם FCS של 5% כדי להתאים ל- 3 x 10⁵ תאים / מ"ל. לאחר מכן, זרעו 1 מ"ל של המדיום על הצלחת המלאכותית המצופה מטריצה חוץ-תאית שהוכנה בשלב 1.2 ודגרו למשך הלילה ב-37°C תחת 5% CO₂. השתמש בהמוציטומטר לספירת מספר תאי הגידול, כולל תאים בודדים וצבירים רב-תאיים (קבוצה של תאים דבקים) בתרחיף התא.
   הערה: 5% FCS משמש כדי להרוות את הפעילות האנזימטית השיורית של collagenase במחקר זה.
4. אספו בזהירות את מדיום התרבית, כולל תאים צפים המנותקים מהצלחת המלאכותית המצופה במטריצה חוץ-תאית, לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ביום המחרת וצנטריפוגה במהירות של 1,400 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה ב 70 μL של מטריצה תאית מלאכותית על קרח.
5. כדי להגביר את הכדאיות של תאי CRC, שכבו את המטריצה החוץ-תאית המלאכותית המכילה תאי גידול על תאי האורגנואיד של הגידול המחוברים לצלחת המצופה מטריצה חוץ-תאית מלאכותית ודגרו במשך 30 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ ממצקים את ציפוי המטריצה החוץ תאי המלאכותי. לאחר מכן, לדגור אותו עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תא אורגנואיד CRC עם 1% FCS ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
6. לשנות את מדיום התרבות כל יומיים. כאשר אורגנואידי CRC ממלאים את המדיום, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום מדי יום.

2. יצירה והעשרה של חלקיקים לנטי-ויראליים GFP

הליכים ניסיוניים ליצירה ולהעשרה של חלקיקים לנטי-ויראליים של GFP מתוארים באיור 1C (שלב 5).

1. תרבית HEK293T תאים עם Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% FCS ולהכין שש מנות 10 ס"מ (2 x 10⁶ תאים לכל מנה) עבור הליך transfection הבא.
2. עבור transfection לכל מנה, להכין 500 μL של תערובת כולל 20 μL של מגיב transfection ב DMEM עם וקטור PRRL-GFP (5 מיקרוגרם) ושני פלסמידים אריזה lentiviral, כגון pCMV-VSV-G (1 מיקרוגרם) ו pCMV-dR8.2 dvpr (5 מיקרוגרם), במיקרו-צינור סטרילי 1.5 מ"ל. שומרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן מניחים אותה על כל אחד מהכלים בקוטר 10 ס"מ ודורים עליהם במשך 18 שעות.
3. מוציאים את המדיום, מוסיפים 5 מ"ל של 10% מדיום FCS-RPMI 1640 טרי לכל מנה, ומשאירים עומד למשך 24 שעות.
4. אספו את התווך הממוזג מכל צלחת לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ואחסנו סך של 30 מ"ל של התווך ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מוסיפים 5 מ"ל של סל"ד טרי 1640 על כל צלחת ומשאירים עומד 24 שעות.
5. לאסוף את המדיום המותנה מכל צלחת לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולשמור, בסך הכל, 30 מ"ל של התווך על קרח. לאחר מכן, השליכו את התאים.
6. סנן 60 מ"ל של המדיום (משלבים 2.4-2.5) דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי להסיר את התאים ולחלק כמות זו לשנים עשר צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן 5 מ"ל עבור אולטרהצנטריפוגה.
7. כדי לרכז וירוסים, צנטריפוגו אותם באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 85,327 x גרם במשך 1.5 שעות ב 4 ° C.
8. הסר מיד את המדיום. כדי לפתור את גלולת הנגיף המרוכזת, יש להניח 250 μL של תערובת F-12 (F12)/DMEM בינונית ללא FCS בכל אחד משנים עשר הצינורות ולשמור אותו על 4 °C למשך הלילה. שים לב כי גלולת הנגיף היא לעתים קרובות בלתי נראית.
9. פיפטה עדינה את המדיום כדי לאסוף 3 מ"ל של מלאי מרוכז 5x GFP lentivirus, בסך הכל, ככל הנראה כולל חלקיקים lentiviral GFP עם 10⁸ יחידות מתמר לכל מ"ל (TU / mL). לאחר מכן, לאחסן את שנים עשר microtubes 1.5 מ"ל (כולל 250 μL לכל צינור) בתנאים סטריליים ב -80 ° C עד שנה. הכינו אליציטוטים קטנים רבים של התמיסה המקורית כדי להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים.

3. תיוג תאי אורגנואיד CRC עם חלקיקים לנטי-ויראליים GFP בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותית

הליכים ניסיוניים לתיוג תאי אורגנואיד CRC עם GFP lentivirus מתוארים באיור 1C (שלב 6).

1. אפשר לאורגנואידים CRC שהוכנו בשלב 1.6 לגדול ללא הפרעה במשך 7-10 ימים, קצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תאים סטרילי, והעבר אותם לתוך microtube 1.5 mL.
   הערה: הגידול של אורגנואידים CRC בתרבית תלוי באופי הגידולים המקוריים מהחולים. הימנע מצמיחת יתר של אורגנואידי CRC על ידי שמירה עליהם במפגש של 60-70% לפני העברתם ביחס פיצול של 1:2 על צלחת מלאכותית חוץ-תאית חדשה מצופה מטריצה בת 12 בארות.
2. צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם, הסר את מדיום התרבית ופתור את גלולת התא ב -500 מיקרוליטר של PBS על ידי הקשה עדינה.
3. צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם וסילוק PBS.
4. כדי לנתק את אורגנואידי CRC הדבקים, הוסף 500 μL של תמיסת ניתוק תאים של אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטים לגלולת התא בצינור וערבב אותה על ידי הקשה עדינה. לאחר מכן, השאירו את הצינורות להסתפק במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
5. בעדינות רבה פיפטה את תרחיף התא עם 500 μL נוספים של 1% FCS-DMEM מספר פעמים במיקרו-צינור 1.5 מ"ל כדי לנתק בערך את התאים. יצירת תאים בודדים מאורגנואידי CRC על ידי פיפטינג קשה מפחיתה באופן ניכר את יכולת הקיום של התא. לכן, חיוני להשאיר את המסה של תאים חזותית לזיהוי השעיית התא על ידי pipetting בעדינות microtube 1.5 מ"ל.
6. צנטריפוגו את מתלה התא למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם והסירו את הסופרנטנט.
7. פתור את גלולת התא עם תערובת של 100 μL של מלאי 5x GFP lentivirus (>10⁸ TU/mL) ו 400 μL של מדיום תרבית אורגנואיד CRC במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל על ידי הקשה עדינה כדי להתאים לריכוז של 5 x 10⁵ תאי גידול מנותקים לכל 500 μL. השתמש בהמוציטומטר לספירת מספר תאי הגידול, כולל תאים בודדים וקבוצות תאים בתרחיף התא, כמתואר לעיל (שלב 1.3).
8. הכינו צלחת מלאכותית חוץ-תאית מצופה מטריצה בת 12 בארות, כמתואר בשלב 1.2. לאחר מכן, מניחים 500 μL של תרחיף התא מוכן בשלב 3.7 על הצלחת ולהשאיר אותו במשך 18 שעות ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
9. אספו את התווך עם התאים הצפים המנותקים מהלוח המלאכותי המצופה מטריצה חוץ-תאית לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגר אותו ב 1,400 x גרם ולאחר מכן להסיר את supernatant ו להשעות מחדש את הגלולה ב 70 μL של מטריצה תאית מלאכותית על קרח.
10. כדי להגדיל את הכדאיות של תאי CRC, שכבו את המטריצה החוץ-תאית המלאכותית המכילה תאי הגידול על אורגנואידי הגידול המחוברים לצלחת 12 בארות מצופה מטריצה חוץ-תאית מלאכותית, כמתואר בשלב 1.5. לאחר מכן, לדגור את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור כדי למצק את ציפוי מטריצה תאית מלאכותית ולאחר מכן תרבית אותו עם 1 מ"ל של מדיום תרבית אורגנואיד CRC עם 1% FCS ב 37 ° C תחת 5% CO₂.
11. התבוננו בתאים שלושה ימים לאחר ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר כמעט 100% חיוביות GFP כתוצאה משימוש בטיטר גבוה של חלקיקים לנטי-ויראליים (ראו איור 2A).
12. תרבית את אורגנואידי CRC במשך 7-10 ימים כדי להרחיב את צמיחת התאים לפני הזרקה לעכברים מושתלים.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של יצירת גרורות על-ידי אורגנואידי CRC שמקורם ב-PDX המסומנים ב-GFP lentivirus בעכברי NOG.(A) השתלת חתיכות קטנות של רקמת CRC באופן תת-עורי בעכברי NOG (שלב 1). רקמת ה-CRC שנותחה בניתוח מהמטופל נחתכה לחתיכות והושתלה תת-עורית בעכברי NOG. S.C.: השתלה תת עורית. (B) יצירת אורגנואידים CRC מנותקים מ-PDX (שלב 2-4). קסנוגרפטים CRC שפותחו נטחנו (של...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 12 בארות	BMBio	#92412
מיקרו-צינור	אפנדורף	#0030120086	אוטוקלאבה לפני השימוש
המוציטומטר	ארמה	#03-202-1
מטריצת קרום מרתף מטריגל	קורנינג	#354234	יש לאחסן את ה-aliquots בטמפרטורה של -20°C. מניחים על קרח עד לשימוש
קולגנאז סוג 1	סיגמא	#C1030	150 מ"ג/מ"ל Collagenase Type1 ב-1×PBS. יש לאחסן aliquots בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנה
DMEM/F-12 עם GlutaMAX™	גיבקו	#10565018
פניצילין	גיבקו	#15140122	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לשימוש תוך חודש
hEGF	פפרוטק	#AF-100-15	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להוסיף למוצר בינוני ביום השימוש
Y27632, מעכב ROCK	וואקו	#253-00591	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C. יש להוסיף למוצר בינוני ביום השימוש
סטרפטומיצין	גיבקו	#15140122	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. לשימוש תוך חודש
מדיום תרבית אורגנואידים CRC עם 1% או 5% FCS			DMEM/F-12 עם תוסף GlutaMAX™ (Gibco #10565018) בתוספת FCS של 1% או 5%, 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 נ"ג/מ"ל hEGF ו-10 μM Y27632, מעכב ROCK. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש להשתמש תוך חודש.
וקטור PRRL-GFP	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
יורש העצר של FuGENE 6 transfection	רוש	11814 443001
pCMV-VSV-G	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
pCMV-dR8.2 DVPR	מתנת ד"ר רוברט א. ויינברג
מיקרוסקופ Zeiss Axioplan 2 סטריאופלואורסצנטי	זיס