$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דיסקציה של CRC PDXs מעכברים
הליכים ניסיוניים לדיסקציה של CRC PDX מתוארים באיור 1B (שלב 2).
- לאפשר לגידול לגדול תת עורית ל~ 1 ס"מ3 בגודל, אשר בדרך כלל לוקח בערך 1-3 חודשים.
- מרדימים את העכבר בשאיפת איזופלורן באמצעות מכשיר הרדמת שאיפת בעלי חיים קטנים ומחטאים את העור באתנול 70%.
- הניחו את העכבר במצב נוטה על ספסל המעבדה. חותכים את העור, חושפים את הגידול ומנתקים בזהירות את העור מהגידול באמצעות מספריים סטריליים. לאחר הסרת הגידול, הניחו אותו על צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ, הסירו את כל האזורים הנמקיים בצורה גסה מהגידול, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם 5 מ"ל של PBS.
הערה: אזורים נמקיים הם לעתים קרובות לבנים יותר, רכים יותר ופריך יותר מהאזורים הסובבים אותם.
- מניחים את הגידול על קרח ומחלקים אותו שווה בשווה ל-4 חלקים לפחות ליישומים שונים, כולל 1) תרבית אורגנואיד CRC, 2) השתלה בעכברים משניים, 3) בדיקה היסטולוגית, 4) הקפאה ואחסון של שברי הגידול.
- עבור הדור של אורגנואידים CRC, מניחים את רקמת הגידול המוצק על צלחת פטרי 6 ס"מ המכילה 1 מ"ל של PBS סטרילי. שמור את הרקמה על קרח עד לעיבוד.
- כדי לבסס את מודל PDX עבור CRC אנושי, העבר את PDX CRC טריים לתוך עכבר משני. חותכים את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ"מ3 בגודל) באמצעות סכיני גילוח סטריליים וטובלים בעדינות את שברי הרקמה האלה לתוך 50 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית. לאחר מכן, השתילו שברים אלה בחלקים התחתונים של הכיסים התת עוריים הימניים והשמאליים של עכבר NOG.
- הניחו את העכבר המרדים במצב נוטה על ספסל המעבדה. בצע חתך קטן בחלקים התחתונים של האגפים הימניים והשמאליים של העכבר המקבל כדי ליצור כיסים תת עוריים להשתלת רקמות באמצעות מספריים סטריליים. היזהר לא לנקב את קרום הצפק. צריך להיות דימום קטן עם הליך זה.
- טבלו בעדינות את שברי הגידול שהוכנו לעיל לתוך 50 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית ולאחר מכן השתילו אותם בחלקים התחתונים של הכיסים התת עוריים הימני והשמאלי.
- תפרו את החתך עם קליפסים לפצעים בעכברים שעברו הליכים כירורגיים. ודא כי רקמות הגידול המושתל ממוקמות במרחק מה מן החתך מתחת לעור.
הערה: בהתאם לצמצום ההליכים הכירורגיים, לא ניתנו במחקר זה טיפולים לכאב לאחר ניתוח ולזיהום.
- הניחו את העכבר על כרית חמה ושמרו על תנוחת השכיבה של עצם החזה עד להכרה מספקת. לאחר החלמתם המלאה ויכולתם לשבת על ארבע רגליהם, ניתן להחזיר את העכברים לכלובי הבית שלהם. כדי למנוע טריפה, אין לאפשר רבייה עם בעלי חיים שאינם מופעלים באותו כלוב.
- לניתוח היסטולוגי, תקן את הדגימות ב 5 מ"ל של פורמלין חוצץ ניטרלי 10% בצינור חרוטי 15 מ"ל בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
- לשימור בהקפאה, חתכו את רקמת הגידול לחתיכות קטנות (5 x 5 x 5 מ"מבגודל 3) וטבלו בעדינות את הדגימות לתוך 500 μL של תמיסת הקפאת תאים בצינורות קריוביאליים של 1-1.5 מ"ל. לאחר מכן, להעביר את הצינור למקפיא -80 מעלות צלזיוס.
2. חילוץ PDX לתוך תרחיף התא עבור תרבית אורגנואיד CRC
הליכים ניסיוניים לדיסוציאציה של CRC PDX מתוארים באיור 1B (שלב 3).
- מניחים את שברי הגידול המוכנים לעיל (שלב 1.4.1) על צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ.
- טחנו את השברים באמצעות סכיני גילוח סטריליים והעבירו אותם לצינור חרוטי בנפח 15 מ"ל המכיל 8 מ"ל של 10% נסיוב עגל עוברי (FCS) - מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) עם 80 מיקרוליטר של מלאי אנזימי קולגנאז (ראו טבלת חומרים).
- סגור את הצינור היטב ועטוף את המכסה בפרפילם כדי למנוע דליפה. כדי לנתק את שברי הגידול הטחון לתוך השעיית התא, לעורר אותו בעדינות במשך 2 שעות ב 37 ° C. שים לב שעדיין יישארו שברים רבים של רקמה לא מעוכלת בצינור.
- צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. פתור את גלולת התא באמצעות 10 מ"ל של 10% FCS-DMEM כדי לבצע את השעיית התא.
- כדי לסלק פסולת רקמות לא מעוכלת, סנן את תרחיף התא פעמיים באמצעות מסננת תאים של 40 מיקרומטר המונחת על צינור חרוטי של 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגו את הזרימה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולשמור את הגלולה על קרח.
3. יצירת אורגנואידים CRC בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותית
הליכים ניסיוניים עבור תרבית אורגנואיד CRC של PDX המעי הגס מתוארים באיור 1B (שלב 4).
- להקים מדיום תרבית המתאים לאורגנואידי CRC שמקורם ב-PDX (ראו טבלת חומרים, "מדיום תרבית האורגנואידים CRC") תוך שימוש במדיה שתוארה קודם לכן עבור אורגנואידים אנושיים של המעי הגס.
- יש למרוח 150 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ראו טבלת חומרים) לכל באר על צלחת של 12 בארות על קרח ולאחר מכן לדגור עליה במשך 30-60 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO2 כדי למצק את הג'לים.
- השהה את גלולת התא משלב 2.5 עם מדיום תרבית האורגנואידים CRC (משלב 3.1) עם 5% FCS כדי להשיג התאמה ל 3 x 105 תאים / מ"ל. לאחר מכן, זרעו 1 מ"ל של המדיום על הצלחת המלאכותית המצופה מטריצה חוץ-תאית שהוכנה בשלב 3.2. ולדגור במשך הלילה ב 37 ° C תחת 5% CO2. השתמש בהמוציטומטר לספירת מספר תאי הגידול, כולל תאים בודדים וצבירים רב-תאיים (קבוצה של תאים דבקים) בתרחיף התא.
הערה: 5% FCS משמש כדי להרוות את הפעילות האנזימטית השיורית של collagenase במחקר זה.
- אספו בזהירות את מדיום התרבית, כולל תאים צפים המנותקים מהצלחת המלאכותית המצופה במטריצה חוץ-תאית, לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ביום המחרת וצנטריפוגה במהירות של 1,400 x גרם למשך 5 דקות. לאחר מכן, הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 70 μl של מטריצה תאית מלאכותית על קרח.
- כדי להגביר את הכדאיות של תאי CRC, שכבו את המטריצה החוץ-תאית המלאכותית המכילה תאי גידול על תאי האורגנואיד של הגידול המחוברים לצלחת המצופה מטריצה חוץ-תאית מלאכותית ודגרו במשך 30 דקות באינקובטור של 37°C, 5% CO2 ממצקים את ציפוי המטריצה החוץ תאי המלאכותי. לאחר מכן, לדגור אותו עם 1 מ"ל של מדיום תרבית תא אורגנואיד CRC עם 1% FCS ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- לשנות את מדיום התרבות כל יומיים. כאשר אורגנואידי CRC ממלאים את המדיום, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום מדי יום.
4. יצירה והעשרה של חלקיקים לנטי-ויראליים GFP
הליכים ניסיוניים ליצירה ולהעשרה של חלקיקים לנטי-ויראליים של GFP מתוארים באיור 1C (שלב 5).
- תרבית HEK293T תאים עם Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני המכיל 10% FCS ולהכין שש מנות 10 ס"מ (2 x 106 תאים לכל מנה) עבור הליך transfection הבא.
- עבור transfection לכל מנה, להכין 500 μL של התערובת, כולל 20 μl של מגיב transfection ב DMEM עם וקטור PRRL-GFP (5 מיקרוגרם)12 ושני פלסמידים אריזה lentiviral, כגון pCMV-VSV-G (1 מיקרוגרם) ו pCMV-dR8.2 dvpr (5 מיקרוגרם), במיקרו-צינור סטרילי 1.5 מ"ל. שומרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות ולאחר מכן מניחים אותה על כל אחד מהכלים בקוטר 10 ס"מ ודורים עליהם במשך 18 שעות.
- מוציאים את המדיום, מוסיפים 5 מ"ל של 10% מדיום FCS-RPMI 1640 טרי לכל מנה, ומשאירים עומד למשך 24 שעות.
- אספו את התווך הממוזג מכל צלחת לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ואחסנו סך של 30 מ"ל של התווך ב -4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מוסיפים 5 מ"ל של RPMI טרי 1640 על כל צלחת ומשאירים עומד במשך 24 שעות.
- לאסוף את המדיום המותנה מכל צלחת לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולשמור, בסך הכל, 30 מ"ל של התווך על קרח. לאחר מכן, השליכו את התאים.
- סנן 60 מ"ל של המדיום (משלבים 4.4-4.5) דרך מסנן 0.45 מיקרומטר כדי להסיר את התאים ולחלק כמות זו לשנים עשר צינורות צנטריפוגות פוליפרופילן 5 מ"ל עבור אולטרהצנטריפוגה.
- כדי לרכז וירוסים, צנטריפוגו אותם באמצעות רוטור דלי מתנדנד (ראה טבלת חומרים) ב 85,327 x גרם במשך 1.5 שעות ב 4 ° C.
- הסר מיד את המדיום. כדי לפתור את גלולת הנגיף המרוכזת, יש להניח 250 μL של תערובת F-12 (F12)/DMEM בינונית ללא FCS בכל אחד משנים עשר הצינורות ולשמור אותו על 4 °C למשך הלילה. שים לב כי גלולת הנגיף היא לעתים קרובות בלתי נראית.
- פיפטה עדינה את המדיום כדי לאסוף 3 מ"ל של מלאי מרוכז 5x GFP lentivirus, בסך הכל, ככל הנראה כולל חלקיקים lentiviral GFP עם 108 יחידות מתמר לכל מ"ל (TU / mL). לאחר מכן, לאחסן את שנים עשר microtubes 1.5 מ"ל (כולל 250 μL לכל צינור) בתנאים סטריליים ב -80 ° C עד שנה. הכינו אליציטוטים קטנים רבים של התמיסה המקורית כדי להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים.
5. תיוג תאי אורגנואיד CRC עם חלקיקים לנטי-ויראליים GFP בתרבית על מטריצה חוץ-תאית מלאכותית
הליכים ניסיוניים לתיוג תאי אורגנואיד CRC עם GFP lentivirus מתוארים באיור 1C (שלב 6).
- אפשר לאורגנואידים CRC שהוכנו בשלב 3.6 לגדול ללא הפרעה במשך 7-10 ימים, קצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תאים סטרילי, ולאחר מכן העבר אותם לתוך microtube 1.5 מ"ל.
הערה: הגידול של אורגנואידים CRC בתרבית תלוי באופי הגידולים המקוריים מהחולים. הימנע מצמיחת יתר של אורגנואידי CRC על ידי שמירה עליהם במפגש של 60-70% לפני העברתם ביחס פיצול של 1:2 על צלחת מלאכותית חוץ-תאית חדשה מצופה מטריצה בת 12 בארות.
- צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם, הסר את מדיום התרבית ופתור את גלולת התא ב -500 מיקרוליטר של PBS על ידי הקשה עדינה.
- צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם וסילוק PBS.
- כדי לנתק את אורגנואידי CRC הדבקים, הוסף 500 μL של תמיסת ניתוק תאים של אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטים לגלולת התא בצינור וערבב אותה על ידי הקשה עדינה. לאחר מכן, השאירו את הצינורות להסתפק במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- בעדינות רבה פיפטה את תרחיף התא עם 500 μL נוספים של 1% FCS-DMEM מספר פעמים במיקרו-צינור 1.5 מ"ל כדי לנתק בערך את התאים. יצירת תאים בודדים מאורגנואידי CRC על ידי פיפטינג קשה מפחיתה באופן ניכר את יכולת הקיום של התא. לכן, חיוני להשאיר את המסה של תאים חזותית לזיהוי השעיית התא על ידי pipetting בעדינות microtube 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגו את מתלה התא למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם והסירו את הסופרנטנט.
- פתור את גלולת התא עם תערובת של 100 μL של מלאי 5x GFP lentivirus (>10,8 TU/mL) ו- 400 μl של מדיום תרבית האורגנואידים CRC במיקרו-צינורית של 1.5 מ"ל על ידי הקשה עדינה כדי להתאים לריכוז של 5 x 105 תאי גידול מנותקים לכל 500 מיקרוליטר. השתמש בהמוציטומטר לספירת מספר תאי הגידול, כולל תאים בודדים וקבוצות תאים בתרחיף התא, כמתואר לעיל (שלב 3.3).
- הכינו צלחת מלאכותית חוץ-תאית מצופה מטריצה בת 12 בארות, כמתואר בשלב 3.2. לאחר מכן, מניחים 500 μl של תרחיף התא מוכן בשלב 5.7 על הצלחת ולהשאיר אותו במשך 18 שעות ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- אספו את התווך עם התאים הצפים המנותקים מהלוח המלאכותי המצופה מטריצה חוץ-תאית לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. צנטריפוגר אותו ב 1,400 x גרם ולאחר מכן להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה ב 70 μl של מטריצה תאית מלאכותית על קרח.
- כדי להגדיל את הכדאיות של תאי CRC, שכבו את המטריצה החוץ-תאית המלאכותית המכילה תאי הגידול על אורגנואידי הגידול המחוברים לצלחת 12 בארות מצופה מטריצה חוץ-תאית מלאכותית, כמתואר בשלב 3.5. לאחר מכן, לדגור את הצלחת במשך 30 דקות ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור כדי למצק את ציפוי מטריצה תאית מלאכותית ולאחר מכן תרבית אותו עם 1 מ"ל של מדיום תרבית אורגנואיד CRC עם 1% FCS ב 37 ° C תחת 5% CO2.
- התבוננו בתאים 3 ימים לאחר ההדבקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר כמעט 100% חיוביות GFP כתוצאה משימוש בטיט גבוה של חלקיקים לנטי-ויראליים (ראו איור 2A).
- תרבית את אורגנואידי CRC במשך 7-10 ימים כדי להרחיב את צמיחת התאים לפני הזרקתם לעכברים מושתלים.
6. יצירת גרורות על ידי אורגנואידים CRC המסומנים על ידי GFP בעכברים מושתלים
הליכים ניסיוניים ליצירת גרורות באמצעות אורגנואידי CRC המסומנים ב-GFP מתוארים באיור 1C (שלב 7).
- כדי לנתק את אורגנואידי CRC המסומנים בתווית GFP לתרחיף התא, קצור אותם באופן מכני באמצעות מגרד תאים סטרילי והעבר אותם למיקרו-צינור של 1.5 מ"ל, כמתואר לעיל (שלב 5.1).
- צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם, הסר את מדיום התרבית ופתור את כדורית התא ב-500 מיקרוליטר של PBS על ידי הקשה עדינה.
- צנטריפוגה את המיקרו-צינור למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם וסילוק PBS.
- שכבו 500 μL של תמיסת ניתוק התא על כדורית התא בצינור וערבבו אותה על ידי הקשה עדינה. לאחר מכן, השאירו את התערובת עומדת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק אנזימטית את אורגנואידי CRC הדבקים, כמתואר לעיל (שלב 5.4).
- בעדינות רבה פיפטה את תרחיף התא עם תוספת של 500 μL של 1% FCS-DMEM מספר פעמים במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל כדי לנתק בערך את התאים, כמתואר לעיל (שלב 5.5). יצירת תאים בודדים מאורגנואידי CRC על ידי פיפטינג קשה מפחיתה באופן ניכר את יכולת הקיום של התא. לכן, להשאיר את המסה של תאים חזותית לזיהוי השעיה התא על ידי pipetting בעדינות microtube 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגו את מתלה התא למשך 3 דקות במהירות של 1,400 x גרם והסירו את הסופרנטנט.
- כדי לבסס מודל עכבר גרורות ספונטני של CRC PDXs:
- הכינו תרחיף תאים הכולל 5 x 105 תאים ב-50 מיקרוליטר PBS עם 50% מטריצה חוץ-תאית מלאכותית לכל עכבר. יש לשמור על המתלים על קרח לפני השימוש. השתמש בהמוציטומטר לספירת התאים הסרטניים, כפי שמצוין בשלב 3.3.
- מרדימים עכבר בשאיפת איזופלורן באמצעות מכשיר הרדמת שאיפת בעלי חיים קטנים ומחטאים את העור באתנול 70%. להבטיח קצב ועומק נשימה תקינים והיעדר רפלקס צביטת בוהן להרדמה נכונה. משחה וטרינרית על העיניים היא אופציה למניעת יובש בעין בזמן הרדמה.
- הניחו את עכבר NOG במצב שכיבה על ספסל המעבדה. אחזו ברירית פי הטבעת בפינצטה סטרילית ומשכו אותה בעדינות מפי הטבעת. לאחר מכן, מיד להזריק את השעיית התא מוכן בשלב 6.7.1 לתוך submucosa פי הטבעת של העכבר באמצעות מזרק (גודל המחט: 22 גרם). באופן שגרתי, 4-6 עכברים לכל קבוצה משמשים להערכת התוצאות.
