ביסוס מודל עכבר גרורות ניסיוני: השתלת תאי אורגנואיד CRC המבטאים GFP במודל PDX לאיתור מיקרוגרורות

תקציר

מקור: Okazawa, Y. et al. זיהוי רגישות גבוהה של מיקרוגרורות שנוצרו על ידי GFP אורגנואידים מותמרים Lentivirus בתרבית מגידול המעי הגס שמקורו בחולה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת גרורות על ידי אורגנואידי CRC הנגזרים מ-PDX המסומנים ב-GFP lentivirus לתוך הטחול של עכבר מדוכא חיסון. מיקרו-גרורות סרטניות המאכלסות איברים אחרים יכולות להיות מזוהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את ביטוי GFP.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. יצירת גרורות על ידי אורגנואידים CRC המסומנים על ידי GFP בעכברים מושתלים

1. כדי לבסס מודל גרורות ניסיוני של CRC PDXs:
   1. הכינו תרחיף תאי אורגנואיד CRC הכולל 4 x 10⁴ תאים ב-50 מיקרוליטר PBS לעכבר. יש לשמור על המתלים על קרח לפני השימוש. השתמש בהמוציטומטר לספירת התאים הסרטניים. (ספרו את מספר תאי הגידול כולל תאים בודדים וצבירים רב-תאיים בתרחיף התא).
   2. מרדימים עכבר בשאיפת איזופלורן באמצעות מכשיר הרדמת שאיפת בעלי חיים קטנים ומחטאים את העור באתנול 70%. להבטיח קצב ועומק נשימה תקינים והיעדר רפלקס צביטת בוהן להרדמה נכונה. משחה וטרינרית על העיניים היא אופציה, כדי למנוע יובש בעין בזמן הרדמה.
   3. הניחו את עכבר NOG המורדם במצב נוטה על ספסל המעבדה. בצע חתך קטן בחלק התחתון של האגף השמאלי ולאחר מכן לחתוך את הצפק כדי לחשוף בזהירות את הטחול באמצעות מספריים סטריליים פינצטה. תופסים את רקמת השומן המחוברת לטחול בפינצטה סטרילית, ואז מזריקים לאט 50 מיקרוליטר של תרחיף התא (שהוכן כאמור לעיל, שלב 1.1) לתוך הטחול. יש לוודא כי מתלה התא מוזרק כראוי ללא דליפה החוצה, מהטחול. באופן שגרתי, 4 עכברים בכל קבוצה משמשים להערכת התוצאות.
2. הניחו את כל העכברים על כרית חמה לאחר הניתוח והחזיקו בתנוחת שכיבה עצם החזה עד להכרה מספקת. לאחר שהעכברים החלימו לחלוטין ומסוגלים לשבת על כל ארבע רגליהם, החזירו אותם לכלובים הביתיים שלהם. כדי למנוע טריפה, אין לאפשר רבייה עם בעלי חיים שאינם מופעלים באותו כלוב.
3. בדוק אם יש דליפת תפרים וודא שהעכברים חיים, בקבוצה שטופלה בניתוח, למחרת. בדוק את העכברים עבור סימני מחלה ולמדוד את גודל הגידול, באמצעות קליפרים, בכל העכברים פעם בשבוע.
4. צפו בעכברים כדי לזהות גרורות ספונטניות (לתקופות של עד חודשיים וחצי) וגרורות ניסיוניות (חודש) לאחר ההזרקה.
5. להקריב את העכברים באמצעות הרדמה ונקע צוואר הרחם בימים שצוינו. לנתח גידולים ראשוניים ורקמות שונות, כולל הכבד והריאות. הניחו את הגידולים והאיברים המנותחים ב-5 מ"ל של PBS קר כקרח על צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ ואחסנו אותם על קרח.
6. כדי לזהות תאי אורגנואיד CRC חיוביים ל-GFP, התבונן ברקמות המנותחות תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. קבל תמונות באמצעות מצלמת CCD והתכונן באמצעות תוכנה סטנדרטית לעיבוד תמונה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG)	המכון המרכזי לחיות ניסוי, קנגאווה, יפן	הרבו עכברים זכרים בני 6 שבועות בתנאים נטולי חיידקים וללא פתוגן ספציפי
אטבי פצעים 2×10 מ"מ	Natsume manufacturing, יפן	#C-21-שניות	אוטוקלאבה לפני השימוש
גודל מחט מזרק המילטון: מד 22	Tokyo Science, יפן	יש לחטא עם 70% אלכוהול ו-PBS סטרילי.
50 מ"ל צינור חרוטי	סומיטומו בקליט	MS-57500
מיקרו-צינור	אפנדורף	#0030120086	אוטוקלאבה לפני השימוש
המוציטומטר	ארמה	#03-202-1
מדיום תרבית אורגנואידים CRC עם 1% או 5% FCS			DMEM/F-12 עם תוסף GlutaMAX™ (Gibco #10565018) בתוספת FCS של 1% או 5%, 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 ng/ml hEGF ו-10 μM Y27632, מעכב ROCK. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C. יש להשתמש תוך חודש.
מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי Zeiss Axioplan 2	זיס