זיהום אדנו-קר סגמנטלי: טכניקה ליצירת סרטן מעי גס מבודד באמצעות מודלים של עכברים מהונדסים גנטית

תקציר

מקור: בצלר, א. מ. ואח' מודל עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס הספורדי.J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את יצירתו של מודל עכבר המעי הגס על ידי זיהום אדנו-קר סגמנטאלי. מקטע המעי הגס הנגוע מוביל לגידולים בתוך קטע זה של הרירית, וכתוצאה מכך אדנומות בסופו של דבר מתקדמות לקרצינומה פולשנית וגרורתית. מודל זה מהווה פלטפורמה אטרקטיבית למחקרים בביולוגיה של סרטן ולניסויים טיפוליים פרה-קליניים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. השראת גידול מקומית באמצעות זיהום אדנו-קר כירורגי

1. הכנת בעלי חיים לניתוח
   הערה: כמעט כל מוטציה מותנית ("floxed") יכולה להיגרם באמצעות השיטה המתוארת כאן. מומלץ להשתמש במוטציות בגנים הרלוונטיים לסרטן המעי הגס, כגון APC, Kras או Tp53. היעילות של רקומבינציית Cre תלויה בגודל המבנה שיש לכרות. רצפים גדולים של floxed נכרתים בצורה פחות יעילה. רקומבינציה של כל האללים צריך להיות מאושר בגידולים על ידי PCR.
   1. להתפתחות גידולים במעי הגס, השתמש בצלב של האללים המותנים הבאים עבור מודל בסיסי של CRC (מספר מסד נתונים MGI בסוגריים):
      Apc^tm2Rak (MGI: 3688435)
      Kras^tm4Tyj (MGI: 2429948)
      Tp53^tm2Tyj (MGI: 3039263)
   2. אם נדרש אלל מדווח פלואורסצנטי (למשל, כדי לזהות מיקרוגרורות), השתמש באלל הבא:
      Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze} (MGI: 3809522)
      הערה: כל הזנים הנ"ל זמינים דרך מאגר העכבר NCI או מעבדת ג'קסון. אין צורך בצום מכיוון שניתן לשטוף את כל החומר הצואתי שנותר לפני הזיהום האדנו-ויראלי. צום לפני הניתוח מוביל לתמותה גבוהה יותר לפני הניתוח ומהווה לחץ עצום עבור מכרסמים קטנים.
   3. השתמש sevoflurane ב 3 - 3.5 vol% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס צביטת הבוהן מעיד על הרדמה מספקת.
   4. לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ"ג / ק"ג של buprenorphine תת עורית.
   5. לכסות את העיניים של העכבר מורדם עם משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
   6. הנח את העכבר במצב שכיבה על שולחן קטן. השתמש בסרטי הדבקה לא טראומטיים כדי לרסן את העכבר.
   7. מגלחים את הבטן במכונת גילוח חשמלית (ניתן להשתמש בקרם אפילטורי לחילופין) ומחטאים במקלוני אלכוהול או יוד. השתמש בזמן יצירת הקשר המומלץ על-ידי היצרן.
   8. לכסות את שדה הניתוח עם וילונות סטריליים.
      הערה: השימוש באנטיביוטיקה פרי-ניתוחית הוא אופציונלי וכפוף להנחיות מוסדיות.
   9. השתמש במכשירים סטריליים חד פעמיים או מעוקרים לכל ההליכים הכירורגיים.
2. לפרוטומיה בקו האמצע וחשיפה של המעי הגס
   1. השתמש מספריים (אזמל יכול לשמש לחלופין) כדי לבצע חתך קו אמצע (~ 15 מ"מ) על העור של הבטן התחתונה.
   2. להרים את שרירי קיר הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו עם מספריים, פתיחת חלל הבטן.
   3. לזהות את המעי הגס הדיסטלי, רק לגעת בו עם מלקחיים א-טראומטיים. הדקו את המעי הגס עם מהדק עדין (למשל, מהדק כלי דם Micro Serrefine) כ-15 מ"מ בסמיכות לפי הטבעת.
      הערה: תן תשומת לב מיוחדת לפגיעות של המעי הגס בכל עת. ניקוב מוביל בהכרח לדלקת הצפק ואלח דם ודורש המתת חסד של החיה.
3. זיהום סגמנטלי במעי הגס עם וירוס Adeno-cre
   1. הכנס צינור טפלון גמיש transanally בזהירות לקדם אותו עד שהוא מגיע חסימת לומן שהושגה על ידי מהדק בעבר ממוקם 15 מ"מ מן הסף אנאלי. אין להשתמש בכוח מופרז מכיוון שהדבר עלול להוביל לניקוב.
   2. קננו את הצינורית עם צינורית 30G, חברו מזרק סטנדרטי של 1 מ"ל, ושטפו את המעי הגס במי מלח רגילים כדי לפנות את שאריות החומר הצואיתי. זה עשוי לדרוש כמה מ"ל של מלוחים.
   3. ברגע שהמעי הגס הדיסטלי מתרוקן, מוציאים את הצינורית ומחליפים אותה בצינור טפלון טרי ושוב מקמים אותה ישירות דיסטלית למהדק כמתואר לעיל.
   4. הסתר את המעי הגס עם מהדק שני ~ 3 מ"מ דיסטלי למהדק הפרוקסימלי (כלומר, מעל הצינור המוחדר, ~ 12 מ"מ משפת פי הטבעת), וכתוצאה מכך קטע מבודד של 3 מ"מ להיות נגוע.
      הערה: עבור חסימה דיסטלית של המקטע, קליפסים של העורקים הכליליים Fogarty הוכיחו את עצמם כמתאימים ביותר מכיוון שהם מגומי, מה שמוביל לחסימה הדוקה של המעי הגס למרות הצינור התוך לומינלי בין ענפי המהדק.
   5. השתמש מזרק שני (סטנדרטי 1 מ"ל עם צינורית 30G) כדי להזריק בזהירות 50 - 80 μL של 0.25% Trypsin-EDTA לתוך קטע המעי הגס המהודק לדגור במשך 10 דקות. השאר את הצינורית ואת המזרק מחובר לצינור טפלון כדי למנוע את דליפת הנוזל בחזרה.
      הערה: המעי הגס חייב להיות מנופח כדי לשבור את מחסום הרירית ולהגיע לתאי הגזע קריפטה, אך לא מנופח מדי כדי למנוע ניקוב של המקטע המהודק.
   6. ראשית, הסר את המהדק הדיסטלי ולאחר מכן את צינור הטריפסין.
   7. שטפו את המעי הגס הדיסטלי עם ~ 500 μL של מי מלח רגילים כדי להסיר את שאריות הטריפסין.
   8. הכניסו צינורית טפלון חדשה, החזירו את המהדק הדיסטלי למקומו, וניפחו את מקטע המעי הגס בתמיסה אדנו-ויראלית של 50-80 מיקרוליטר (10¹¹ יחידות יוצרות פלאק (PFU)/מ"ל במי מלח חוצצי פוספט) ודגרו במשך 30 דקות (איור 2A).
      הערה: אין לשפוך תמיסה ויראלית מכיוון שמגע עם אדנו-קר עלול להוביל להתפתחות גידול בכל רקמה של עכברים מוטנטיים מותנים.
   9. הסר את מלחציים ואת הצינור.
4. סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח
   1. סגור את דופן הבטן עם 6-0 תפרים רצים הניתנים לספיגה מהירה (למשל, פולידיוקסאנון (PDS)).
   2. סגור את העור עם קליפסים פצע כירורגי.
   3. הניחו את העכבר על כרית חימום המוגדרת לטמפרטורה של 38°C עד להתאוששות מלאה מההרדמה.
   4. יש לתת בולוס נוסף של 0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין I.P. 12 שעות לאחר הניתוח, ואחריו בולוסים נוספים של בופרנורפין כל 12 שעות במידת הצורך.
   5. יש לעקוב אחר העכברים לפחות פעם ביום לאיתור סימני מצוקה עקב צמיחת הגידול.

2. קולונוסקופיה

הערה: בהתאם למוטציות המותנות המשמשות, זיהום אדנו-ויראלי מוביל לגידולים אנדוסקופיים גלויים תוך 2 - 4 שבועות. לכן, בצע את הקולונוסקופיה הראשונה לאחר הניתוח 2 שבועות לאחר אינדוקציה adenoviral לחזור כל 2 שבועות. מערכת זמינה מסחרית מומלצת עבור קולונוסקופיה murine.

1. הכנת בעלי חיים לקולונוסקופיה
   הערה: אין צורך בצום. החומר הצואתי הנותר בדרך כלל נוצר היטב במעי הגס הדיסטלי וניתן לדחוף אותו מעבר לגידול במהלך קולונוסקופיה, מה שהופך את התהליך המלחיץ של צום חוזר למיותר.
   1. השתמש sevoflurane ב 3 - 3.5 vol% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס צביטת הבוהן מעיד על הרדמה מספקת.
   2. לכסות את העיניים של עכברים מורדמים עם משחה אופתלמית כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
   3. לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן.
2. קולונוסקופיה
   1. הכנס את ההיקף (קוטר 1.9 מ"מ; אורך 10 ס"מ) למערכת העיכול דרך פי הטבעת והכנס בזהירות אוויר תחת בקרה חזותית כדי להרחיק את המעי הגס. אין לשאוב יותר אוויר מהנדרש לבדיקה.
      הערה: עבור אי-ספיקת אוויר, ניתן להשתמש במשאבת האוויר נגד ערפל של מערכת הקולונוסקופיה. אם אין משאבת אוויר נגד ערפל זמינה, ניתן להשתמש בכל משאבת אוויר אחרת עם הגדרות לחץ נמוך מאוד או באוויר בלחץ עם שסתום עדין להפחתת לחץ. פחמן דו חמצני (CO₂) מוביל בקלות לחמצת במכרסמים קטנים ולכן יש להימנע ממנו.
   2. דחפו בזהירות את הטווח קדימה עד שניתן יהיה לזהות נגע רירית במעי הגס הדיסטלי (איור 1A – 1D).
   3. שמור תמונות אנדוסקופיות להערכה מאוחרת יותר. מערכת ניקוד אנדוסקופית לגידולים תוך לומינליים תוארה בעבר.
   4. הסר בזהירות את ההיקף והנח את העכבר על כרית חימום המוגדרת ל -38 מעלות צלזיוס עד שהוא יתאושש לחלוטין מההרדמה.

תוצאות

איור 1. תמונות קולונוסקופיות של גידולים במעי הגס (אללים מותנים של החיה הנתונה בסוגריים).
A. מעי גס דיסטלי תקין. ב. אדנומה מוקדמת שבועיים לאחר זיהום אדנו-קר. שים לב לצבע הירוק עקב אלל כתב GFP בעכבר זה. (Apc^tm2Rak, Kras^tm4Tyj, Gt(ROSA)26Sor^{tm6(CAG-ZsGreen1)Hze}). ג. אדנומה מאוחרת (Apc^tm2Rak, Kr...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים	לייף טכנולוגיות GmbH	14190169
טריפסין-EDTA (0.25%, PhenolRed)	לייף טכנולוגיות GmbH	25200072
מי מלח רגילים 0.9% (E154)	Serumwerk ברנבורג AG	10013
Aqua ad injectabilia	ב. בראון Melsungen AG	235144
Ad5CMV-Cre (אדנווירוס, c = 2E +11 PFU/מ"ל)	העברת גנים וקטור ליבה אוניברסיטת איווה
15 מ"ל, 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות	גריינר Bio-One GmbH	188271/227270
צינורות אפנדורף 1.5 מ"ל / 2 מ"ל	Sarstedt AG ושות'	72,695,400
צלחת פטרי PS 100/15 מ"מ (סטרילי, נוקלון)	פישר סיינטיפיק GmbH	10508921/ NUNC150350
1 מ"ל מזרק (ללא נפח מת) - Injekt-F SOLO	בראון/neoLab	194291661
מחט הזרקה 30G	בקטון דיקינסון	304000
סבופלורן (Sevoflurane AbbVie)	AbbVie גרמניה GmbH ושות' KG
חמצן רפואי	Air Liquide Medical GmbH
Buprenorphine (Temgesic)	Indivior Eu בע מ
Bepanthen - משחה אופתלמית	Bayer Vital GmbH	10047757
שולחן עליון מחקר מכונת הרדמה x/O2 סומק עם וופורייזר Sevoflurane	פארקלנד סיינטיפיק	V3000PS/פקיסטני
מקלוני תאית	Lohmann & Rauscher Deutschland	13356
מזרק אינסולין EMG 1 מ"ל (עם צינורית 30G)	ב. בראון Melsungen AG	9161627S
צינורות Fine Bore (משעמם: 0.28 מ"מ / קוטר: 0.61 מ"מ)	סמיתס מדיקל דויטשלנד 8	800/100/100
מיקרו-אדסון מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11018-12
איריס מספריים - ToughCut	כלים מדעיים משובחים	14058-11
מחזיק מחט אולסן-הגר	כלים מדעיים משובחים	12002-12
ערכת קליפ אוטומטי	כלים מדעיים משובחים	12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (תפר כירורגי)	Johnson & Johnson Medical GmbH	Z1012H
מהדק כלי דם Micro Serrefine מעוקל	כלים מדעיים משובחים	18055-05
Fogarty אביב קליפים	אדוארדס	CDSAFE 6
פלטה חמה 062	לבוטקט	13854
Isis - מכונת גילוח לשיער	אסקולאפ - בראון
מזרקת אור קר קסנון 175	קרל סטורץ	20132101-1	קרל סטורץ קולווויו סיסטם מיינץ
כבל אור סיב אופטי	קרל סטורץ	69495NL	קרל סטורץ קולווויו סיסטם מיינץ
ראש מצלמה תלת-שבבי TRICAM	קרל סטורץ	20221030	קרל סטורץ קולווויו סיסטם מיינץ
יחידת בקרת מצלמות TRICAM SLII	קרל סטורץ	20223011-1	קרל סטורץ קולווויו סיסטם מיינץ
צג מסך שטוח בגודל 15 אינץ' EndoVue	קרל סטורץ	9415NN	קרל סטורץ קולווויו סיסטם מיינץ
טלסקופ HOPKINS ישר קדימה קוטר 1.9 מ"מ; אורך 10 ס"מ משולב העברת אור סיב אופטי אוטומטי	קרל סטורץ	64301AA
מעטפת הגנה ובדיקה	קרל סטורץ	61029ג