בדיקת קשירת מיקרוטובולים בתאי CRC: שיטה לבחינת חלבון טאו קושר מיקרוטובולים בתאי סרטן המעי הגס

תקציר

מקור: Huda, M. N., et al. Assay for phosphorylation and microtubule binding יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את הבדיקה קושרת המיקרוטובולים המשמשת להפרדת חלבון טאו קושר מיקרוטובול ממקטעי חלבון טאו היפרפוספורילציה שאינם קושרים בתאי סרטן המעי הגס. בדיקה זו מסייעת לקבוע את ההשפעה של כימיקלים שונים שיכולים לשנות את מצב הזרחן של חלבון טאו, ולהשפיע על קשירת המיקרוטובולים שלו.

פרוטוקול

1. בדיקת קשירת מיקרוטובול

1. לבדיקת קשירת מיקרוטובול, יש להוסיף ~ 1 x 10⁶ HCT 116 תאים לצלחות תרבית רקמה בקוטר 100 מ"מ המכילות את המדיה החיונית המינימלית (MEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר יום אחד של תרבית, התאים יגיעו למפגש של 60-70%.
2. הכן מאגר PEM 1X (2 מ"ל) ממאגר PEM 10X המאוחסן ב- 4 ° C על ידי הוספת 20 μM (40 μL) paclitaxel ו- 1 mM (20 μL) GTP. קח את מלאי microtubule (MT) ממקפיא -80 ° C ואת מלאי E. coli tau עובד ממקפיא -20 ° C.
3. הכינו דוגמאות לפי טבלה 1.
4. יש לדגור ב-37°C למשך 30 דקות. אולטרה-צנטריפוגה ב-25°C למשך 60 דקות ב-100,000 x גרם.
5. מעבירים 120 μL של סופרנאטנטים המכילים טאו לא קשור, לצינורות נקיים ומסומנים.
6. מוסיפים 120 μL (אותו נפח כמו סופרנטנט) של חיץ דגימה פי 5 לגלולה המכילה טאו קשור ומערבבים היטב. העבירו את התמיסה לצינורות מסומנים נקיים וערבבו היטב.
7. מדוד את ריכוז החלבון על ידי בדיקת ברדפורד באמצעות ערכות מסחריות לבדיקת חלבון.
   הערה: בעת הכנת הדגימות, השתמש בנפח התמיסה (שלב 1.6) להכנת דגימות הגלולה והסופרנטנט.
8. הכינו דגימות של ריכוז חלבון שווה ערך והוסיפו חיץ העמסת ג'ל SDS טרי 4x SDS המכיל DTT (400 mM).
   הערה: דגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C בשלב זה.
9. יש לדגור על הדגימות על בלוק חום בטמפרטורה של 100°C למשך 5 דקות. מערבבים את הדגימות באמצעות מערבולת. מצננים בטמפרטורת החדר למשך ~10-15 דקות.
10. הרכבת מערכת אלקטרופורזה להפעלת ג'ל 10% פוליאקרילאמיד על ידי SDS-PAGE.
    1. יש להעמיס 10 מיקרוגרם חלבון (דגימה של 13 μL) לכל באר על ג'ל 10% פוליאקרילאמיד. העמיסו על סולם המשקל המולקולרי.
    2. לאחר טעינת הדגימה, חבר את האלקטרודות החיוביות והשליליות של מערכת האלקטרופורזה למקור חשמל כדי לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל ב 70 V למשך 20 דקות כדי להעביר את דגימות החלבון מג'ל הערימה לתוך ג'ל הפתרון. לאחר מכן, הגדל את המתח ל 125 V והפעל את הג'ל במשך כ 70-120 דקות עד דגימות וסולם חלבון להגיע לסוף הג'ל.
    3. לאחר השלמת האלקטרופורזה, מעבירים את הג'ל לקרום PVDF באמצעות מערכת אלקטרובלוטינג רטובה. העברה במשך ~ 100 דקות ב 100 V.
    4. סמן את הכתם על ידי ביצוע חתך קטן בצד סולם המשקל המולקולרי. השתמש יריעת פלסטיק שקופה חותך חד לחיתוך הכתם.
11. חסום את הממברנה במאגר חוסם BSA 4% למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
12. לדגור את הכתם בתמיסת נוגדנים ראשונית (אנטי-טאו בקנ"מ 1:5,000) ב-4°C למשך הלילה. שטפו את הכתם ב-PBST ארבע פעמים, למשך 7 דקות כל אחת.
13. הכינו את תמיסת הנוגדנים המשנית הרלוונטית (IgG נגד עכבר עיזים בקנ"מ 1:5,000), ודגרו על הכתם במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף ב-PBST ארבע פעמים, למשך 7 דקות כל אחת.
14. לפתח את הכתם באמצעות ערכת chemiluminescence בהתאם להמלצות היצרן. מכסים את הכתם בניילון נצמד שקוף. לרכוש תמונות על ידי מערכת הדמיה chemiluminescence עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטית.

טבלה 1: הכנת הדגימה לבדיקת קשירת מיקרוטובול.

לדוגמה	שם	מיקרוטובול דרוש:	חלבון עיקרי נדרש	PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-Control (6.21 מיקרוגרם/מיקרוליטר)	2 μl	9.66 מיקרוליטר (60 מיקרוגרם)	108.34 מיקרוליטר
2	HCT 116-כורכומין 10 מיקרומטר (4.81 מיקרוגרם/מיקרוליטר)	2 μl	16.63 מיקרוליטר (80 מיקרוגרם)	101.37 מיקרוליטר
3	HCT 116-כורכומין 20 מיקרומטר (3.28 מיקרוגרם/מיקרוליטר)	2 μl	30.49 מיקרוליטר (100 מיקרוגרם)	87.51 מיקרוליטר
4	HCT 116-LiCl 25 מילימטר (5.43 מיקרוגרם/מיקרוליטר)	2 μl	18.42 מיקרוליטר (100 מיקרוגרם)	99.58 מיקרוליטר
5	אי קולי טאו	2 μl	1 μl tau-352	117 מיקרוליטר
6	MT בלבד	2 μl	X	118 μl
				120 מיקרוליטר כל אחד

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תא HCT 116	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	היקלון	SH30024.01
צלחת 100 מ"מ	קורנינג	430161
נוגדן נגד טאו 13	ABCAM	dorit_19030
Dithiothreitol (DTT)	רוש	10 708 984 001	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
מיקרוליטר צנטריפוגות	Hettich Zentrifugen	מיקרו 200 R
פאקליטקסל	סיגמא-אולדריץ'	T1912	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
כורכומין	סיגמא-אולדריץ' (פלוקה)	78246	טמפרטורת אחסון: 2-8 °C
מיקרוטובולים (MT)	שלד ציטו-שלד	MT001	יש לאחסן ב-4°C (מיובש)
נתרן הידרוקסידי	סיגמא	72068
מגנזיום כלורי	סיגמא-אולדריץ'	M2670
GTP	סיגמא-אולדריץ'	G8877	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
DPBS	וולג'ין	ל"ב 001-02
סוניק דיסמברטור	פישר סיינטיפיק	דגם 500
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	אופטימה L-100 XP
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא	A7906
Molecular Imager	ביו-ראד	ChemiDoc XRS+	יש לאחסן ב-4°C
חלבון assay מגיב צבע	ביו-ראד	500-0006
α-טובולין (11H10) ארנב mAb	איתות סלולרי	2125
GAPDH (14C10) ארנב mAb	איתות סלולרי	2118
נוגדן נגד טאו (phospho S396)	אבקאם	ab109390
Tau-352 אנושי	סיגמא	טלפון 9950	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C
קרום PVDF	ביו-ראד	162-0177
סודיום דודציל סולפט (SDS)	אפימטריקס	75819
בדיקת חלבון	ביו-ראד	500-0006	יש לאחסן ב-4°C
נוגדן משני IgG נגד עכבר עיזים	תרמופישר	A-11005	יש לאחסן ב-4°C בחושך