בידוד CTC מדגימת דם שלמה: שיטה להשגת CTCs ממודל סרטן המעי הגס מורין

תקציר

מקור: Kochall, S., et al. בידוד של תאי גידול במחזור הדם במודל עכבר אורתוטופי של סרטן המעי הגס. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גידול במחזור הדם מכל דגימת הדם של מודל עכבר גידול מעי גס שעבר המתת חסד. ניתן לתרבית CTCs מבודדים אלה ולהשתמש בהם לניתוח מיועד במורד הזרם.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד תאי גידול במחזור הדם מדגימות דם שלמות

הערה: להשיג דם על ידי ניקוב לב transcutaneous על עכברים מורדמים, ואחריו המתת חסד. באופן אידיאלי, 1,000 מיקרוליטר של דם נשאבים לתוך מזרק ממולא מראש עם 100 μL של נוגד קרישה (חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או הפרין). השתמש בנוגדן אנטי-אנושי-EpCAM (מולקולת הידבקות תאי אפיתל) כדי לזהות את CTCs. זה עובד טוב מאוד אם קווי תאי אפיתל אנושיים משמשים במודל העכבר. עבור יישומים אחרים, ייתכן שיהיה צורך בנוגדנים שונים.

1. העשרת CTC:
   1. מלא מראש צינורות 15 מ"ל עם מדיום שיפוע צפיפות 5 מ"ל בזהירות להעביר את הדם לתוך צינור 15 מ"ל.
   2. צנטריפוגה (30 דקות ב 300 x גרם ללא בלם) ובזהירות להסיר את supernatant העליון.
   3. יוצקים את השאר לתוך צינור 15 מ"ל חדש וצנטריפוגה (15 דקות, 300 x גרם עם בלם).
   4. לשחזר את interphase המכיל את התאים mononuclear (להשליך את השאר) ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
   5. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-200 μL PBS/1% EDTA ולהוסיף 4 μL של נוגדן EpCAM. לדגור 20 דקות על קרח בחושך.
2. סינון וליקוט
   1. הכינו את החיץ הבא (להלן נקרא חיץ קטיף): PBS + 10% סרום עגל עוברי (FCS) + 1% פניצילין/סטרפטומיצין (1%) + 0.8% EDTA.
   2. השתמש בעט PAP כדי לצייר עיגול ~ 1 ס"מ בצלחת פטרי סטרילית 6 ס"מ (מונע מהנוזל להתפזר בצלחת), ומזלף 700 μL של חיץ קטיף לתוך עיגול זה.
   3. הוסף 50 μL של תרחיף תאים למאגר הליקוט 700 μL בתוך המעגל. בדוק את צפיפות התאים עם המיקרוסקופ. חלקו את המדגם למנות שונות אם הוא צפוף מדי.
   4. המתן עד שהתאים יירגעו (~ 5 דקות).
   5. מסך את טיפת תרחיף התא עבור תאים מוכתמים (= חיוביים ל- EpCAM).
   6. ברגע שתא נמצא, בחר את התא עם המיקרומניפולטור ושים אותו במאגר של 50 μL בהתאם לניתוח המיועד במורד הזרם (למשל, מאגר מיצוי RNA או מדיום תרבית).
   7. בהתאם לניתוחים המיועדים במורד הזרם, בודד תאים שליליים מסוג EpCAM ו/או בינוניים כפקדים שליליים.
   8. המשך עם ניתוחים במורד הזרם (למשל, תרבית תאים, PCR).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מדיום שיפוע צפיפות – Ficoll	StemCell - Lymphoprep	7801
Alexa Fluor 488 שיבוט נוגדנים CD326 אנטי-אנושי (EpCAM) 9C4	ביולג'נד	324210
Alexa Fluor 488 נגד עכבר CD326 (EpCAM) שיבוט נוגדנים G8.8	ביולג'נד	118210
צלחת פטרי, ø 60 x 15 מ"מ, 21 ס"מ, פתח אוורור	גריינר ביו-וואן	628102
מיקרוסקופ תרבית תאים פלואורסצנטי	לייקה
Transferman 4r Micromanipulator	אפנדורף
סלטראם אייר	אפנדורף		משאבת שאיפה המחוברת למיקרומניפולטור
Dmz אוניברסלי Microelectrode Puller	חברת דגן		נדרש לייצור נימים זעירים לשאיפה של תא בודד
נימי זכוכית פריזמה	חברת דגן
עט פאפ	אבקאם
פוספט של דולבקו חוצץ מלוחים	לייף טכנולוגיות GmbH	14190169	ליקוט חיץ
סרום עגל עובר (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	ליקוט חיץ
פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)	לייף טכנולוגיות GmbH	15140122	ליקוט חיץ
EDTA	רוט	8040.1	ליקוט חיץ
אימונוהיסטוכימיה
שיבוט נוגדנים מטוהרים נגד אדם CD326 (EpCAM) 9C4	ביולג'נד	324201	אימונוהיסטוכימיה EpCAM
ארנב HRP נגד עכבר IgG	אבקאם	ab97046	אימונוהיסטוכימיה EpCAM