$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנה אורגנוטיפית:
הכנת ג'ל אורגנוטיפי ספוג פיברובלסט:
- הכינו תרחיף תאי פיברובלסט המכיל 5 x 105 תאים לכל אורגנוטיפית ב-DMEM בתוספת 10% FCS ו-292 מיקרוגרם/מ"ל L-גלוטמין.
- הרכיבו את הג'לים האורגנוטיפיים על קרח ביחסים הבאים:
- • 7 כרכים של קולגן זנב חולדה: תערובת מטריג'ל (1:1)
- • נפח אחד של 10x DMEM מסונן
- • כרך אחד של FCS
- • נפח אחד של תרחיף תאי פיברובלסט המכיל 5 x 105 פיברובלסטים
עבור 9 ג'לים (1 מ"ל לג'ל), להכין 10 מ"ל ולערבב בעדינות כדי למנוע בועות.
- הוסיפו 1 מ"ל לכל באר של צלחת בת 24 בארות ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה כדי לאפשר לג'ל להתייצב. לאחר שעה, יש להוסיף 1 מ"ל DMEM (10% FCS)/Glut על גבי הג'לים ולחזור לאינקובטור למשך הלילה.
- למחרת, לשאוף בינוני מהחלק העליון של הג'לים צלחת 1ml של מדיה המכילה 5 x 105 CRC תאי אפיתל.
הכנת יריעות ניילון מצופות ג'ל:
- הכינו מראש יריעות ניילון סטריליות אוטוקלאביות בגודל 1.5X1.5 ס"מ.
- בעזרת מלקחיים סטריליים מניחים את מספר יריעות הניילון הנדרש בכלי תרבית בקוטר 10 ס"מ (בדרך כלל ניתן להכיל 4 יריעות ניילון בכל צלחת).
- איפור ג'ל על קרח בסדר הבא (250 μl נפח כולל נדרש לכל יריעת ניילון):
- • 7 כרכים של קולגן זנב-חולדה
- • נפח אחד של 10x DMEM מסונן
- • כרך אחד של FCS
- • נפח אחד של DMEM 10% FCS/Glut
- אם התמיסה צהובה, נטרלו על ידי הוספת 0.1 M NaOH ב-50 μl aliquots עד שהתמיסה הופכת לוורודה.
- הוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסה זו לכל יריעת ניילון ודגרו בטמפרטורה של 37°C באווירה לחה של 5% CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'ל להתייצב.
- איפור 1% תמיסת גלוטראלדהיד ב-PBS. יש להוסיף 10 מ"ל לכל צלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ לאחר שהג'ל התייצב ולדגור על 4°C למשך שעה אחת.
- יש לשטוף יריעות ניילון 3x ב-PBS ו-1x ב-DMEM (10% FCS)/Glu ולדגור לילה ב-DMEM/Glu בטמפרטורה של 4°C.
העלאת ג'לים אורגנוטיפיים על רשתות פלדה לפלישה:
- הכינו מראש רשתות פיגומים על ידי קיפול יריעות נירוסטה לתצורת חצובה. אוטוקלאבה לפני השימוש.
- השתמש במלקחיים מעוקרים באתנול כדי למקם רשת פלדה בכל באר של צלחת שש בארות.
- הניחו יריעת ניילון מצופה ג'ל עם צד הקולגן העליון ביותר, על כל רשת.
- מעבירים בזהירות את הג'לים האורגנוטיפיים מהצלחת בעלת 24 הבארות ליריעת הניילון המוגבהת באמצעות מרית מעוקרת באתנול.
- מלא את הבאר עם DMEM 10% FCS / Glut בתוספת 10% FCS עד יריעת הניילון הוא במגע עם המדיום אבל לא שקוע. ודא שהמדיום אינו נוגע בג'ל האורגנוטיפי.
- יש לדגור במשך 14 ימים בטמפרטורה של 37°C (75°F) באטמוספירה לחה של 5% CO2, ולהחליף מדיה כל יומיים.
2. קיבוע אורגנוטיפי
- מוציאים מהבאר יריעה אורגנוטיפית שלמה כולל יריעת ניילון ומניחים על סרט נצמד.
- חותכים יריעה אורגנוטיפית וניילון בעזרת אזמל חד פעמי נקי ומקבעים את שני החצאים בפורמלדהיד למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
- יש להחליף את הפורמלדהיד באתנול 70% לאחר 24 שעות ולהשאיר למשך הלילה לפני ההטבעה בפרפין, חתך והכתמה.
3. מיקרודיסקציה בלייזר של השוליים הפולשניים
- חתך לעובי 10 מיקרומטר על שקופיות המותקנות על הממברנה.
- נטרלו חלקים על ידי מריחת קסילן למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסירו את הקסילן וקבעו 75% אתנול למשך דקה אחת נוספת.
- הסר אתנול וכתם עם תמיסת 0.125% Cresyl Violet למשך דקה אחת. Cresyl Violet מדגיש תאי אפיתל ומאפשר הבחנה קלה מהסטרומה.
- יש להסיר את Cresyl Violet ולמרוח 100% אתנול למשך דקה נוספת לפני שטיפה עם 100% אתנול. הניחו למגלשות להתייבש באוויר למשך 30 דקות.
- בצע מיקרודיסקציה בלייזר באמצעות הפלטפורמה שנבחרה (למשל, מערכת Leica AS).
- הניחו את מגלשת הזכוכית עם החלק המוכתם כך שינותחו במיקרו עם הפנים כלפי מטה על במת המיקרוסקופ.
- הרכיבו צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 מ"ל לתוך קלטת האיסוף והוסיפו 50 מיקרוליטר של חיץ ליזה תאי (למשל, DNA, RNA או חיץ ליזה חלבוני) למכסה שלתוכו תאסוף רקמה שנותחה במיקרו.
- תחת ראייה ישירה, להשתמש בג'ויסטיק כדי לזהות את הרקמה המעניינת. באמצעות ממשק התוכנה, הוסף הערות לחלק האורגני המוכתם, תוך הדגשת תאים שיש לנתח במיקרו בחזית הפלישה לגידול.
- הורו ללייזר לירות, אשר אמור גם לחתוך את החלק המודגש וגם להניע רקמה חתוכה לתוך המכסה של צינור המיקרוצנטריפוגה.
- לאחר שנאסף מספיק חומר, הוציאו את קלטת האיסוף, סגרו את צינור המיקרוצנטריפוגה וסובבו בעדינות כדי למשוך את חיץ הליזיס לתחתית הצינור.
- הניחו דגימות על קרח עד להשלמת המיקרודיסקציה. דגימות תהליך בשיטה מתאימה כדי לחלץ את הניתוח של עניין.