בדיקת ציטומטריית מתיחה: שיטה לכימות כוח המתיחה המופעל על ידי תאים סרטניים ב- ECM

Abstract

מקור: Ali, M. Y., et al. בידוד תאי גידול ראשוניים במעי הגס האנושי מרקמות כירורגיות וגידולם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לצורך ציטומטריית מתיחה. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מתאר את בדיקת מיקרוסקופ כוח המתיחה. הבדיקה קובעת את המתיחה התאית של תאי סרטן המעי הגס האנושי על המטריצה החוץ תאית הקיימת על הידרוג'ל אלסטי רך בעל חרוזים פלואורסצנטיים משובצים. התזוזה המתקבלת של חרוזים פלואורסצנטיים נמדדת באמצעות תוכנה מתאימה.

Protocol

1. בדיקת מיקרוסקופ כוח משיכה

1. חם 0.25% טריפסין-EDTA/10% SDS פתרון ב 37 ° C באמבט מים במשך 10 דקות לפני תחילת ניסויי המתיחה.
2. הסר ג'ל אחד (פונקציונליזציה של ג'ל PA וזכוכית עם מולקולות ECM, פיברונקטין אנושי בריכוז של 50 מיקרוגרם/מ"ל) מאינקובטור תרבית התאים בזמן ובמקום על במת המיקרוסקופ ההפוך הפלואורסצנטי (הגדלה פי 32).
3. חפש תא בודד בשדה הראייה. הסירו את מכסה צלחת הפטרי.
4. צלמו תמונת ניגודיות פאזה של התא (לדוגמה, איור 1).
5. העבר את מצב ההדמיה לפלואורסצנטיות ובחר את המסנן המתאים. אל תזיזו את שלב המיקרוסקופ או הדגימה במהלך פרק זמן זה.
6. צלמו את החרוזים הפלואורסצנטיים שהוחלפו על-ידי המתיחה התאית (איור 2C).
7. הוסף 1 מ"ל תמיסת טריפסין/SDS לצלחת פטרי כדי לנתק את התא מהג'ל. אל תזיזו את שלב המיקרוסקופ או הדגימה במהלך פרק זמן זה. כמו כן, צלם תמונת בקרה של התא כדי להבטיח הסרה מלאה מהג'ל.
8. צלם תמונת הפניה (כוח ריק) של החרוזים לאחר הסרת התא.
9. חזור על שלבים 1.2-1.8 עבור כל הג'לים האחרים.
10. צור אוסף תמונות באמצעות ImageJ משתי התמונות שנרכשו בשלבים 1.6 ו- 1.8 לכל מקרה. ליצירת אוסף התמונות, השתמשו ברצף הפקודות הבא ב- ImageJ לאחר פתיחת התמונות: Image → Stacks →- Images to stack.
11. כדי להשיג את שדה העקירה ואת המתיחה, השתמש בתוספים של ImageJ בעקבות שיטות שפורסמו. השג קודים ומדריכים מפורטים עבור תוספים אלה באמצעות הקישור הבא: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. יישרו את התמונות בערימה באמצעות תוסף 'התאמת תבניות'. השתמש ברצף הפקודות הבא ב- ImageJ לאחר פתיחת אוסף התמונות שנוצר בשלב 1.10: תוספים → התאמת תבניות → יישור פרוסות באוסף → אישור. שמור את אוסף התמונות כתוצאה מכך. השתמש באוסף תמונות חדש זה בשלבים הבאים.
    2. השיגו את שדה העקירה באמצעות תוסף PIV (מהירות תמונת חלקיקים) (איור 2D). השתמש ברצף הפקודות הבא לאחר פתיחת אוסף התמונות שנשמר בשלב 1.11.1: תוספים → PIV → PIV איטרטיבי (בסיסי) → אישור → קבל PIV זה ופלט → אישור. שמור את פלט ה- PIV באותה ספרייה כמו באוסף התמונות המקורי. השתמש באפשרות זו כקלט בשלב הבא.
    3. לבסוף, השתמשו בתוסף FTTC (ציטומטריית המתיחה של התמרת פורייה) כדי לקבל את מפת המתיחה (איור 2E). השתמש ברצף הפקודות הבא: תוספים → FTTC → הוספת תכונות חומר, כלומר, המודולוס של יאנג והיחס של פואסון לג'ל PA → אישור → בחר את קובץ פלט PIV שנשמר בשלב 1.11.2 → אישור. שמור תוצאות FTTC באותה ספרייה כמו באוסף התמונות ובפלט PIV.

Results

איור 1. תרבית תאי מעי גס ראשונית ראשונית מוצלחת (הן סרטן והן נורמלי) על ג'לים נוקשים שונים ועל צלחת פוליסטירן. תמונות עם ניגודיות פאזה מציגות מורפולוגיה אופיינית של (A) תאי גידול ו-(B) תאים נורמליים על מצעי קשיחות שונים.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	לונזה	17-516F
טריפסין	וורטינגטון	LS003736
אקרילאמיד	סיגמא-אולדריץ'	A4058
N-מתילן ביסקרילאמיד (bis)	סיגמא-אולדריץ'	M1533
פיברונקטין אנושי	BD biosciences	354008
0.1 מיקרומטר חרוזים פלורוזצנטיים	טכנולוגיות חיים	F8801
0.25% טריפסין-EDTA	טכנולוגיות חיים	25200-056
12 מ"מ2 החלקות כיסוי זכוכית	קורנינג	2865-12