בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

1. בדיקות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית

1. קח את המצע עם תאים להיות immunostained על מכסה המנוע הלמינרי ולהסיר את מדיה תרבית.
2. שטפו את המצע עם PBS וקיבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות ב-RT.
3. שטפו את המצעים עם PBS שלוש פעמים (5 דקות בכל פעם). כתוצאה מכך, לדגור על המצע עם משפר אות 500 μl במשך 30 דקות ולשטוף עם PBS.
4. לדגור על תאים עם נוגדן חד שבטי אנטי וינקולין בדילול 1:250 ב- PBS למשך 45 דקות ב- RT. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
5. דגרו על הדגימות עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG בדילול של 1:200 ב- PBS ב- RT למשך 30 דקות. שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
6. כדי להמחיש את מבנה F-אקטין יש לדגור על תאים עם מצומדים לפלואידין TRITC בריכוז של 50 מק"ג/מ"ל למשך 45 דקות ב-RT. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
7. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (איור 1A-1D).

איור 1. צביעה אימונופלואורסצנטית של F-אקטין ווינקולין על כמוסת ג'ל ומצעי פוליסטירן קשים.לא נמצאו סיבי אקטין בתא הגידול הפחות מפוזר (A1) או (A2) בתא רגיל על ג'לים רכים של 2 kPa. עם זאת, הידבקויות מוקדיות המכילות ניקוב וינקולין קיימות על כמוסות ג'ל (B1-B2). לעומת זאת, תאים ראשוניים מראים מורפולוגיה מפוזרת היטב, סיבי עקה אקטין מוגדרים היטב (C1-C2), והידבקויות מוקדיות מוארכות בדידות (D1-D2) על מצעי פוליסטירן קשיחים.