בדיקת ארגון ציטו-שלד והדבקה מוקדית: שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לחקר הידבקות תאים והתפשטותם על מצעים

תקציר

מקור: Ali, M. Y et al., בידוד תאי גידול ראשוניים במעי הגס האנושי מרקמות כירורגיות וגידולם ישירות על מצעים אלסטיים רכים לצורך ציטומטריית מתיחה. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של לימוד שלד ציטו-שלד והידבקויות מוקדיות בתאי סרטן המעי הגס האנושיים הראשוניים כדי להבין את הווריאציות שלו בהתאם לקשיחות המצע. תרבית זו של תאים סרטניים על מצעים רכים וקשים מאפשרת מדידות ביופיזיקליות שונות במורד הזרם לפרוגנוזה של סרטן.

פרוטוקול

1. בדיקות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית

1. קח את המצע עם תאים להיות immunostained על מכסה המנוע הלמינרי ולהסיר את מדיה תרבית.
2. שטפו את המצע עם PBS וקיבעו את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 20 דקות ב-RT.
3. שטפו את המצעים עם PBS שלוש פעמים (5 דקות בכל פעם). כתוצאה מכך, לדגור על המצע עם משפר אות 500 μl במשך 30 דקות ולשטוף עם PBS.
4. לדגור על תאים עם נוגדן חד שבטי אנטי וינקולין בדילול 1:250 ב- PBS למשך 45 דקות ב- RT. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
5. דגרו על הדגימות עם נוגדן משני Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG בדילול של 1:200 ב- PBS ב- RT למשך 30 דקות. שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
6. כדי להמחיש את מבנה F-אקטין יש לדגור על תאים עם מצומדים לפלואידין TRITC בריכוז של 50 מק"ג/מ"ל למשך 45 דקות ב-RT. לאחר מכן, שטפו את המצעים עם PBS 3 פעמים (5 דקות בכל פעם).
7. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי (איור 1A-1D).

תוצאות

איור 1. צביעה אימונופלואורסצנטית של F-אקטין ווינקולין על כמוסת ג'ל ומצעי פוליסטירן קשים.לא נמצאו סיבי אקטין בתא הגידול הפחות מפוזר (A1) או (A2) בתא רגיל על ג'לים רכים של 2 kPa. עם זאת, הידבקויות מוקדיות המכילות ניקוב וינקולין קיימות על כמוסות ג'ל (B1-B2). לעומת זאת, תאים ראשוניים מראים מורפולוגיה מפוזרת היטב, סיבי עקה אקט...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
PBS	לונזה	17-516F
פרפורמאלדהיד	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	RT15710
משפר אותות	טכנולוגיות חיים	I36933
נוגדן חד שבטי נגד וינקולין	סיגמא-אולדריץ'	V9131
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG	טכנולוגיות חיים	A11001
TRITC phalloidin מצומדים	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1951
חומרים
12 מ"מ2 החלקות כיסוי זכוכית	קורנינג	2865-12