הכנת בלוק רקמת עור קפואה: פרוטוקול לשימור דגימות מלנומה עורית מהעור הגבי של מורין

תקציר

מקור: Moon, H., et al. בקרה מרחבית וטמפורלית של התחלת מלנומה מורין מתאי גזע מלנוציטים מוטנטיים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט לבידוד עור גבי מורין המכיל מלנומה, ואחריו הטבעה בהקפאה להכנת בלוק רקמת עור קפואה. ניתן לחתוך את בלוק הרקמה המוטבע בהקפאה ולבדוק אותו מיקרוסקופית כדי לחקור את התקדמות המלנומה.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד רקמות

1. בידוד עור
   1. השג את הפריטים הבאים לפני שתתחיל: מכשירי נקרופסי, נייר סינון ומגבות נייר.
   2. יש להרדים את העכברים על פי פרוטוקולים מאושרים, ולאשר את המוות לפני ההליך.
   3. בעזרת קוצץ שיער, יש לגלח את כל השיער מאזור העור הגבי. הברישו קלות את האזור ברקמה נטולת סיבים כדי לנקות את האזור.
   4. בצע חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל בסיס הזנב.
   5. הכנס מספריים קהות גדולות לתוך החתך והפרד את רקמות החיבור התת עוריות.
   6. בודד בזהירות את אזור העור המעניין על ידי חיתוך עם מספריים חדים לאורך קצה הרקמה.
   7. הניחו את רקמת העור על מגבת נייר נקייה והשתמשו במלקחיים עמומים כדי למתוח את העור כך שיידבק למגבת ויהיה מתוח. שלב זה משמש כדי לספק תמיכה נוספת לרקמה, כך שניתן יהיה לתפעל ולעבד אותה תוך שמירה על צורתה.
      הערה: היזהר לטפל רק באזורים החיצוניים של רקמת העור, שכן המלקחיים עלולים לגרום נזק לעור אשר ניתן לראות היסטולוגית.
2. קיבוע רקמות
   1. קפלו פיסת נייר סינון לשניים ותייגו בהתאם. הניחו את העור יחד עם גב מגבת הנייר לתוך הנייר המקופל הסמוך לקמט, וודאו שהדגימה חלקה ולא מקופלת או מקומטת. אטם את נייר הסינון על-ידי הידוק הדפנות הפתוחות ולאחר מכן חתוך כך שניתן יהיה להשתמש בנייר שנותר לדוגמאות עתידיות.
      הערה: שלב זה מבוצע כך שהעור שומר על צורתו במהלך הקיבוע.
   2. יש לטבול לחלוטין את דגימת הרקמה בפורמלין חוצץ ניטרלי 10% למשך 3 עד 5 שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C.
   3. לאחר הקיבוע, להסיר את הדגימות פורמלין, לשטוף במים deionized (2x 5 דקות כל אחד) ולהמשיך לעשות בלוקים רקמות. יש להסיר בזהירות כל שאריות חומר מרקמת העור (כלומר, שאריות נייר).
3. יצירת גושי רקמות קפואים (איור 1)
   1. חותכים את הקצוות של דגימת העור כך שהם לא משוננים ולאחר מכן לבצע 3 חתכים sagittal. רוחב רצועות אלה לא צריך להיות יותר מגובה הקריומולד (5 מ"מ). לאחר מכן, בצע חתכים רוחביים כדי לקבל חתיכות עור שאינן ארוכות יותר מרוחב הקריומולד (20 מ"מ) וניתן להטמיע אותן. חזור על הפעולה עם החצי הנותר של העור הגבי, או שמור את הרקמה לשימושים אחרים (לחלופין, שמור חצי לפני הקיבוע).
      הערה: חשוב לשמור על חתיכות העור בכיוון הנכון.
   2. כיוון את הקריומולד (25 x 20 x 5 מ"מ³) בכיוון לאורך והנח 4 עד 5 חתיכות עור על גבי ה- OCT. לאחר שכל החלקים נמצאים במקומם, השתמשו ב-2 זוגות מלקחיים עדינים כדי להביא את הקצה הארוך של העור לתחתית הקריומולד. העור צריך כעת לעמוד ב-OCT בניצב לבסיס התבנית. דאגו למזער את היווצרותם של כיסי אוויר בתוך ה-OCT במהלך השלב הזה (איור 1).
   3. ממלאים את התבנית ב-OCT עד לשפה השנייה, ומניחים אותה על משטח שטוח של קרח יבש. השתמשו במלקחיים כדי להתאים את כל פיסות העור שאולי זזו במהלך ההעברה כשהבלוק מתחיל לקפוא. ברגע שהשכבה התחתונה מתמצקת, מניפולציה של רקמות תהיה בלתי אפשרית.
   4. גזור שקופיות של 8-10 מיקרומטר לניתוח.
4. יצירת בלוקי רקמה משובצים פרפין קבוע פורמלין (FFPE)
   1. יש להכניס 2 חתיכות של עור קבוע לקסטה מסומנת ולייבש בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול (75% אתנול למשך 30 דקות, 85% למשך 30 דקות, 90% למשך 30 דקות, 95% למשך 30 דקות, 100% למשך 2x 30 דקות, תחליף קסילן או קסילן למשך 2x 30 דקות). יש לדגור עם פרפין בטמפרטורה של 58-60 מעלות צלזיוס, תחילה למשך 30 דקות ולאחר מכן למשך הלילה.
   2. הטמע את הרקמה בתבנית רקמת נירוסטה²⁴ x 24 מ"מ עם פרפין נוזלי והתמצק ב -5 ° C. כיוון הרקמה צריך להיות דומה לזה של גושי רקמות קפואים, כך שניתן יהיה להמחיש מקטעים אורכיים על פני זקיקי שיער מרובים (איור 1).
   3. לאחר שהפרפין התמצק, הסר את התבנית וחתך אותה לחלקים של 5-10 מיקרומטר לניתוח.

תוצאות

איור 1: בידוד רקמת עור והטבעה בהקפאה. לאחר המתת חסד, יש לגלח את אזור העור הגבי של העכבר המעניין ולהטמיע את העור בקריומולד המכיל OCT. הקו המקווקו בעכבר מייצג את קו האמצע. בדרך כלל, 3 או 4 חתיכות עור ניתן לבודד עם קטע קו 3-4 לאורך קו האמצע; חתיכה אחת כזו מסומנת על ידי מלבן 1/2/3/4. פיסות עור אלה צריכות להיות מוטמעות ב-OCT כפי שמוצג באיור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
גוזם שיער לחיות מחמד	וואהל	09990-502
קרם להסרת שיער	נאיר	לא ישים	ניתן להשיג ברוב בתי המרקחת
צמר גפן	מגוון
נורה אולטרה סגולה	UVP	95-0042-08	דגם XX-15M מנורת UV בינונית
אתנול 200 הוכחה	מגוון		אתנול טהור
Histoplast PE	פישר סיינטיפיק	22900700	כדורי פרפין
פורמלין חוצץ ניטרלי, 10%	סיגמא	HT501128-4 ליטר
מתחם O.C.T.	תרמו	23730571
קלטת טישו	סאקורה	89199-430	לעיבוד FFPE
קריומולדס	סאקורה	4557	25 x 20 מ"מ
תבנית מתכת FFPE	לייקה	3803082	24 מ"מ x 24 מ"מ
איזופלורן	מגוון		כיתה וטרינרית
מערכת שאיפת הרדמה	מגוון		כיתה וטרינרית
מספריים עדינים	FST	14085-09	ישר, חד/חד
מספריים עדינים	FST	14558-09	ישר, חד/חד
Forcep	FST	11252-00	דומונט #5
Forcep	FST	11018-12	מיקרו-אדסון
צור-קרייר; LSL-BrafV600E; Pten f/f	מעבדות ג'קסון	13590
LSL-tdעגבניות	מעבדות ג'קסון	7914	liat14