מידול Xenograft הנגזר מהמטופל: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי מלנומה

תקציר

מקור: Min Xiao et al. מודל קסנוגרפט שמקורו בחולה מלנומה. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, תאי מלנומה שמקורם בבני אדם מושתלים באופן תת-עורי באזור האגף של עכבר מדוכא חיסון. מודל PDX מאפשר חקירה פרה-קלינית של תאי מלנומה המשחזרים טוב יותר את ההטרוגניות של הגידול ואת אגרסיביות המלנומה שנצפתה בתנאי in vivo.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד רקמת גידול להשתלת עכבר

1. כריתה כירורגית או עיבוד רקמת ביופסיה כירורגית
   1. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית ומפרידים ככל האפשר את רקמת הגידול מהרקמה הנורמלית שמסביב.
   2. הסר רקמה נמקית (המזוהה בדרך כלל כרקמה חיוורת-לבנה הממוקמת במרכז הגידול) מהגידול הנותר ככל האפשר.
   3. השתמשו באזמל כדי לחלק גוש גידול ראשוני לחתיכות שוות בקירוב (~3 מ"מ x 3 מ"מ) להשתלת עכבר כירורגית (איור 1).
   4. לחלופין, אם יש מספיק רקמת גידול זמינה, יש להקפיא את הרקמה לבדיקות במורד הזרם (ריצוף RNA [RNASeq], ריצוף אקסומי שלם [WES] וכו').
   5. הפוך את הגידול slurry על ידי טחינת רקמת הגידול באמצעות טכניקה להב צולב עם שני להבי אזמל. טחנו את גושי הגידול דק ככל האפשר כדי ליצור תרחיף, אשר מוכן כעת להשתלת עכבר כירורגית.
   6. לחלופין, אם רקמת הגידול קשה מדי לדיסוציאציה מכנית, השתמש בהליך דיסוציאציה של עיכול כדי ליצור תרחיף דמוי ג'ל ותרחיף חד-תאי להשתלה ו / או הזרקה.
      1. טוחנים את גושי הגידול דק ככל האפשר כדי ליצור תרחיף.
      2. שים את slurry בצינור 50 מ"ל עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק קר (HBSS)^-/- (ללא Ca⁺⁺ ו- Mg⁺⁺); לאחר מכן, צנטריפוגה את הגלולה ב 220 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C.
      3. יש להשהות מחדש את התרחיף ב-10 מ"ל של חומר עיכול טרי ומחומם (200 U/mL collagenase IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/mL DNase ^ב-HBSS-/-) לכל 1 גרם של רקמת גידול.
      4. הכניסו את הצינור לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות וערבבו במרץ כל 5 דקות עם פיפטה חד פעמית.
      5. לשטוף עם עד 50 מ"ל של ^HBSS-/-; לאחר מכן, צנטריפוגה ב 220 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C.
      6. הוסף 5 מ"ל TEG שחומם מראש (0.025% טריפסין + 40 מיקרוגרם/מ"ל אתילן גליקול-ביס(β-אתר אמינואתיל)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית [EGTA] + 10 מיקרוגרם/מ"ל אלכוהול פוליוויניל [PVA]) לכל 1 גרם של רקמת גידול, השהה מחדש / נער בעדינות, והנח את הצינור על 37 ° C למשך 2 דקות ללא ערבוב.
      7. הוסף לפחות נפח שווה אחד של חומר צביעה קרה (אלבומין בסרום בקר 1% [BSA] + 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES] + 1x פניצילין-סטרפטומיצין במדיה L15) כדי להרוות את הטריפסין והצנטריפוגה ב 220 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C.
      8. השהה מחדש את הדגימה ב-10 מ"ל של חומר צביעה לכל 1 גרם של רקמת גידול וסנן אותה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר כדי לקבל תרחיף חד-תאי להזרקת עכבר (איור 1).
      9. ניתן לאסוף גם תרחיף שנותר על גבי מסננת התא להשתלת עכבר כירורגית.
2. השתלת גידול והזרקתו בעכברים
   1. השתלת כריתה כירורגית או רקמת ביופסיה כירורגית
      הערה: ודא שכל כלי הניתוח סטריליים על ידי autoclaving או שימוש במכשירים חד פעמיים מעוקרים מראש.
      1. יש לגלח את השיער מהגב התחתון של עכברים זכרים או נקבות בני 6-8 שבועות ולהשאיר אזור בגודל של כ-1.5X3 ס"מ ללא שיער. מרדימים עכברים באמצעות isoflurane ולאשר על ידי לחיצה עדינה על כף הרגל כמבחן של תגובה. השתמשו במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע יובש.
      2. מניחים עכברים בודדים על כרית חום בחרוט האף של מכונת ההרדמה, מקרצפים את האזור המגולח עם כלורהקסידין. לאחר מכן, לטבול עם 70% אתנול ולאפשר לו להתאדות.
      3. הכינו נתחים או חלקו את תמיסת הגידול בצלוחית פטרי לתלוליות בודדות להשתלה כירורגית (כלומר, לשלוש תלוליות שוות אם רוצים להשתיל אותן ב-3 עכברים).
      4. בעזרת להב האזמל מבצעים חתך באורך של כ-5 מ"מ במרכז גב העכבר, לוקחים זוג מלקחיים אחד ומרימים את העור בצד החתך שממול למפעיל.
      5. קחו את המספריים ביד השנייה והפרידו את העור משכבת השריר על ידי חיתוך עדין של קרום הפשיזם בחתכי מספריים קטנים, ובכך יצרו "כיס" לרקמת הגידול.
      6. הרימו גוש גידול אחד או תלולית בודדת אחת של רקמת גידול עם להב האזמל והכניסו בעדינות את הרקמה לכיס שנוצר.
      7. יש לתת 100 μL של מטריצה חוץ-תאית מלאכותית על תלולית רקמת הגידול בכיס.
      8. בעזרת שני זוגות מלקחיים, מושכים את החתך בשני קצותיו כך שקצוות הפצע יתקרבו זה לזה, וסוגרים את הפצע על ידי מריחת קליפס פצע אחד או שניים.
      9. תת עורית להזריק 1-5 מ"ג / ק"ג meloxicam כמו משכך כאבים בעכברים לאחר הניתוח.
      10. הוציאו את העכבר מחרוט האף והחזירו אותו לכלוב המקורי שלו; התבוננו בעכבר בזמן שהוא מתעורר. אין לחזור לכלוב עד להחלמה מלאה.
      11. יש להסיר קליפסים לפצעים לאחר כ-7 ימים. אם הריפוי אינו מושלם לאחר 7 ימים, השאירו את אטב הפצע למשך יום או יומיים נוספים.
          הערה: אם משתמשים בתרחיף תא בודד מכריתה כירורגית או עיבוד רקמת ביופסיה כירורגית, הוא יתערבב עם מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (ביחס של 1:1) להזרקת עכברים.
   2. הזרקת FNA או רקמת ביופסיית ליבה
      1. הנח עכבר NSG על מדף רשת פלדה, החזק את העכבר בחוזקה בזנב ומשוך בעדינות את העכבר לאחור. הוא יתפוס את הרשת ברגליו הקדמיות בחוזקה. לחלופין, יש לרסן את העכבר ביד הלא דומיננטית ולתת לאזור האגף להיות גלוי.
      2. לחטא את העור של האגף עם מקלונים להכנת אלכוהול. לאט ובהתמדה להזריק את התוכן של מזרק מתחת לעור של העכבר.
      3. משוך את המחט והחזיר את העכבר לכלוב שלו.
3. מעקב אחר צמיחת הגידול
   1. עקוב אחר עכברים פעם בשבוע כדי לבדוק גידולים מוחשיים.
   2. ברגע שהגידולים מגיעים לגודל מדיד (כ-50 מ"מ³), השתמשו בקליפר כדי לתעד את ממדי הגידול. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את נפחי הגידול: (רוחב x רוחב x אורך) / 2.
   3. קציר הגידול ברגע שנפח הגידול מגיע לכ-1.5 ס"מ³ (כ-4-10 שבועות). הגידול נקרא כיום מעבר עכבר 1 (MP1).

תוצאות

איור 1: שיטות השתלה חלופיות.(A) גידולים יכולים להיות מעובדים לגושים, תרחיף תרחיף או כתרחיף חד-תאי. (B) כל שלוש השיטות יאפשרו צמיחה של גידולים in vivo. מוצגים כאן עכברים שהושתלו תת עורית עם הגידול ומצולמים 12 יום לאחר ההשתלה. (C) מוצגות עקומות גדילה של הגידול עבור העכברים שהוזרקו להם אחת משלוש שיטות ההשתלה. N = 5 לכל זרוע; קווי שגיאה הם שגיאה רגילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מטר Hepes	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	חתול # 15140163
1x HBSS-/- (עם Ca++ או Mg++)	מד	חתול # MT21-023-CV
2.5% טריפסין	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # T4549-100ML	10 מ"ל aliquots מאוחסן ב –20oC
BSA	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # A9418-500G
כלורהקסידין	פישר סיינטיפיק	חתול# 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u/mL)	וורטינגטון	חתול #4189	איפור HBSS-/- ממלאי אבקה Collagenase IV (Worthington #4189, u / mg מצוין על בקבוק ומשתנה עם כל הרבה); הקפאה 1
DMSO	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # C6295-50ML
דנאז	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # D4527
EGTA (אתילן גליקול ביס(2-אתר אמינואתיל)-N,N,N'N'-חומצה טטראצטית)	מרק	חתול # 324626.25
פ.ב.ס.	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	חתול # 16000-044
פטריות	INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES	חתול # 15290-018
גנטמיצין	פישר סיינטיפיק	חתול # BW17518Z
איזופלורן	הנרי שיין בריאות בעלי חיים	חתול # 050031
המדיה L15 של לייבוביץ	Invitrogen	חתול # 21083027
מטריג'ל	קורנינג	חתול # 354230	מטריצה חוץ-תאית מלאכותית
מלוקסיקאם	הנרי שיין בריאות בעלי חיים # ::הנרי שיין	חתול # 025115	1-5 מ"ג/ק"ג, כמשכך כאבים
עכברי NOD/SCID/IL2-receptor null (NSG)	מכון ויסטאר, מתקן לבעלי חיים		הרבייה
PVA (אלכוהול פוליוויניל)	תאגיד סיגמא-אולדריץ'	חתול # P8136-250G
RPMI 1640 בינוני (Mod.) 1X עם L-גלוטמין	פישר סיינטיפיק	חתול# MT10041CM
אזמל	נוצה	חתול # 2976-22
קליפסים לפצעים	מיקרון	חתול #427631