שיטת Hanging Drop: טכניקה ליצירת ספרואידים תלת ממדיים למלנומה

תקציר

מקור: Müller, I. et al., מודל עור תלת ממדי אורגנוטיפי של מלנומה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת ספרואידים תלת מימדיים בשיטת הטיפה התלויה באמצעות תאי מלנומה. המודל התלת-ממדי של מלנומה ספרואידית אורגנוטיפית (3D) שנוצר במבחנה יכול לתאר את ארכיטקטורת in vivo של מלנומה ממאירה ועשוי לספק תובנות לגבי אינטראקציות תוך-גידוליות.

פרוטוקול

1. יצירת ספרואידים תלת ממדיים למלנומה בשיטת הטיפה התלויה

1. תרבית תאי מלנומה (למשל, 451-LU, או כל קו תאי מלנומה מעניין) על פי פרוטוקולים כלליים, באמצעות RPMI המכיל 10% FCS.
   1. כדי לייצר ספרואידים של מלנומה בגודל ובאיכות דומים, שטפו את תאי המלנומה ב-PBS, הוסיפו 5 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA ב-PBS לתאים בצלוחית תרבית תאי T175, ודגרו במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). נטרל את הטריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל סל"ד / 10% FCS. קצרו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות. השהה מחדש את גלולת התא בסל"ד / FCS בריכוז סופי של 10,000 תאים / מ"ל כפי שנקבע על ידי ספירה בהמוציטומטר.
2. נקודה 40 x 25 μL (= 250 תאים) של תרחיף התא על פני השטח הפנימי של מכסה צלחת תרבית תאים סטרילית לא דבקה (Ø 10 ס"מ) באמצעות רב פיפטה אלקטרונית. בתנועה מהירה אך חלקה, סובבו את המכסה והניחו אותו על צלחת תרבית התאים המתאימה המכילה 5 מ"ל PBS.
   1. תרבית "צלחות טיפה תלויות" באינקובטור התא ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 10-14 ימים, בהתאם לסוג התא בשימוש.
      הערה: תאים משלב צמיחת המלנומה הגרורתית בדרך כלל גדלים מהר יותר ויוצרים ספרואידים מוצקים יותר בטיפה התלויה, בהשוואה לתאי מלנומה שמקורם בשלב הצמיחה הרדיאלית או בשלב הצמיחה האנכית. להערכה אישית, צפו בצמיחת ספרואידים מתחת למשקפת או תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 4). בדרך כלל, ספרואידים ניתנים לגילוי לאחר 48 שעות תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (הגדלה פי 4). לאחר 10-14 ימים, הם גלויים ללא כל מכשיר הגדלה.
3. חמישה ימים לאחר זיהוי הירידה הראשונית, הוסף 10 μL של סל"ד טרי / 10% FCS בינוני לכל טיפה. לאחר מכן, להחליף 10 μL של בינוני כל יומיים. השימוש במתקן אלקטרוני מועיל מאוד בשלב זה.
4. בהתאם לסוג התא, לקצור את spheroids לאחר 10-15 ימים. שטפו בזהירות את הספרואידים מהמכסה של צלחת תרבית תאי הטיפה התלויה עם PBS. אספו 10-20 ספרואידים בצלחת סטרילית של תרבית תאים לא דביקה. בזהירות להסיר PBS מוגזם עם פיפטה פסטר.
   הערה: תקופת הגידול תלויה בשלב צמיחת הגידול של תאי המלנומה כאשר הם נגזרו לראשונה, למשל, ספרואידים שמקורם בתאי 451-LU גדלים לקוטר של כ-500 מיקרומטר תוך 12 יום מהתרבית בטיפת התלייה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום עוברי (FCS)	תרמו פישר סיינטיפיק	10270106	הוסף 10% למדיום תרבית התאים
טריפסין-EDTA	תרמו פישר סיינטיפיק	25300054	1X מדולל ב-PBS
סל"ד	תרמו פישר סיינטיפיק	61870010	לטיפוח קווי תאי מלנומה