יצירת שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים: הליך לביסוס מודל עור תלת ממדי באמצעות דגימות עור אנושיות

תקציר

מקור: Müller, I. et al. מודל עור תלת ממדי אורגנוטיפי מסוג מלנומה. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט ליצירת שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים במבחנה לחקר התקדמות המלנומה. מודל עור זה מחקה הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איברים in vivo.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. בידוד קרטינוציטים ראשוניים מהאפידרמיס

1. לשטוף את רקמת האפידרמיס עם PBS. חותכים את האפידרמיס לחתיכות קטנות יותר (1 מ"מ²) ואוספים אותם בצינור חרוטי 50 מ"ל. מוסיפים 10 מ"ל 1x טריפסין-EDTA (מחומם מראש ל-37°C) ודגרים במשך 5 דקות באמבט מים ב-37°C. מערבבים את תרחיף הרקמה כל 2 דקות.
2. עצור את התגובה האנזימטית על ידי הוספת 1 מ"ל סרום עגל עוברי (FCS). להשהות מחדש את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה עם פיפטה פלסטיק 10 מ"ל במשך 4 דקות. נסו להימנע מבועות והיווצרות קצף.
3. יש להכניס את תרחיף התא לתוך מסננת תאים (גודל נקבוביות 100 מיקרומטר), מונח על גבי צינור חרוטי טרי של 50 מ"ל, ולשטוף 3x עם PBS של 5 מ"ל. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. להשהות מחדש את גלולת התא בתווך תרבית 2-6 מ"ל המכיל 1% (v/v) gentamycin. קבע את מספר התא באופן ידני על ידי ספירת תאים בהמוציטומטר וזרע 6 x 10⁵ תאים לתוך בקבוק תרבית תאים T75.

2. בידוד פיברובלסטים ראשוניים מהדרמיס

1. חותכים את רקמת העור לחתיכות קטנות יותר (1 מ"מ²) ומעבירים אותם לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל תמיסת collagenase (5 U / mL ב ^PBS+) ודגר במשך 45 דקות באמבט מים ב 37 ° C. צנטריפוגה את תערובת חתיכות רקמה ותאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות.
2. שטפו את גלולת התא פעמיים עם 10 מ"ל DMEM המכיל 4.5 גרם / ליטר גלוקוז ו- L-גלוטמין, אך ללא L-פירובט. לבסוף, להשעות מחדש את חתיכות הרקמה ב 2 מ"ל של DMEM המכיל 1% (v/v) gentamycin ו 10% FCS. מעבירים אותם לבקבוק תרבית תאי T25 ודגרים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ למשך הלילה.
   הערה: הנפח הקטן מאפשר לפיברובלסטים לנדוד החוצה מפסולת הרקמה ומאלץ אותם להיצמד לצלוחית התרבית.
3. למחרת בבוקר, להוסיף עוד 6 מ"ל DMEM / Gentamycin/FCS ולדגור במשך 2-3 ימים ב 37 ° C עד התאים הגיעו 80-90% מפגש.

3. יצירת התא העורי של שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים

1. צור מודלים של עור באמצעות תוספות קרום מיקרו-נקבוביות של תאים 24 בארות (גודל נקבוביות 8 מיקרומטר) הממוקמות בצלחות של 24 בארות.
   הערה: הקפידו לא להשתמש בתוספות תלויות אלא בעמידה, מכיוון שהן יוכנסו לצלחת בת 6 בארות לטיפוח נוזל אוויר בשלב מאוחר יותר.
2. הכינו את תמיסת נטרול הג'ל (GNL), כמו גם את אמצעי התרבית המכונה MM ומדיה לגידול אנדותל (EGM). כדי למנוע קרישה, יש לאחסן את הקולגן מסוג I (בדרך כלל מזנב חולדה, 3.5-4 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.02 N) על קרח עד לשימוש מכיוון שהוא מתחיל לג'ל ב-RT.
3. יש להשהות מחדש 1 x 10⁵ פיברובלסטים לכל תוספת ב-GNL ולערבב במהירות את תרחיף התאים עם קולגן ביחס של 1:3 בנפח סופי של 500 μL/insert. יש לערבב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות בועות, שכן בועות עלולות לפגוע באיכות השחזור של העור.
4. אפשרו לג'לים העוריים הנפרדים לשקוע על ידי שמירתם ללא מדיום ב-RT למשך 30 דקות במכסה מנוע סטרילי. לאחר מכן, יש לכסות כל ג'ל ב-DMEM המכיל 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, 1% L-גלוטמין, 10% FCS וללא L-פירובט, ולדגור למשך הלילה ב-37°C.

4. יצירת תא האפידרמיס של שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים

1. למחרת, להסיר את המדיום מן ג'ל עורי ולאזן אותם עם מדיה EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 מ"ג / מ"ל gentamicin) במשך 2 שעות ב 37 ° C. למשוך את המדיום בזהירות זרע 1 x 10⁵ keratinocytes resuspended ב 100 μL EGM על גבי ג'ל עורי.
2. לדגור על השחזורים במשך 1.5 שעות ב 37 ° C כדי לאפשר keratinocytes להיצמד לתא העור.
   הערה: במהלך זמן הדגירה הזה, הג'לים יתחילו להתכווץ עקב התכווצות הנגרמת על ידי פיברובלסט, ובכך לפחות באופן חלקי יתנתקו מדפנות ההחדרה.
3. מכסים את העור המקביל בכ-800 μL EGM ומסירים בזהירות את שאריות הג'ל מקיר ההחדרה עם קצה פיפטה קטן (לבן). תרבית את המקבילות לעור שקועות ב-EGM במשך 7 ימים באינקובטור תאים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂, והחליפו את המדיום כל יומיים.
   הערה: במהלך תקופה זו, המקבילות לעור יתכווצו באופן משמעותי.

5. טיפוח נוזל אוויר של שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים

1. ביום 8, מעבירים כל תוספת לבאר נפרדת של צלחת 6 בארות. יש להוסיף רק 1.2-1.4 מ"ל של מדיום MM לכל באר, כך ששחזור העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך אינו מכוסה במדיום.
   הערה: טיפוח בממשק אוויר-נוזל מאפשר ריבוד של חלק האפידרמיס ויצירת שכבה מלאה של קרנית (שכבה קרנית).
2. במהלך 10-17 הימים הבאים, שנה את המדיום כאמור בסעיף 5.1 אחת ליומיים. במהלך תקופה זו, להוסיף תרופות או גירויים אחרים לפי הצורך למדיום. הסירו בזהירות את שחזור העור המלא מהחדרת הממברנה המיקרו-נקבובית באמצעות פינצטה מעוקלת לניתוח נוסף, למשל ניתוח אימונוהיסטוכימי (איור 1).

תוצאות

איור 1: טיפוח של שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים שקועים בתווך ובממשק אוויר-נוזל. ביום 0, קרטינוציטים ראשוניים נזרעים על גבי התא העורי המורכב מפיברובלסטים ראשוניים המוטבעים במטריצת קולגן מסוג I. שחזורי עור תלת ממדיים נשארים מעובדים שקועים ב-EGM במשך 7 ימים, מתנתקים מדופן ההחדרה ומתחילים להתכווץ. ביום 8 מעבירים את התוספות ל-6 בארות ומעובדים בממשק אוויר-נוזל כדי לאפשר ריבוד אפידרמיס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלבומין בסרום עוברי (FCS)	תרמו פישר סיינטיפיק	10270106	הוסף 10% למדיום תרבית תאים
טריפסין-EDTA	תרמו פישר סיינטיפיק	25300054	1X מדולל ב-PBS
DMEM	תרמו פישר סיינטיפיק	41965062	לטיפוח פיברובלסטים ראשוניים
דיספסי	טכנולוגיות החיים של Gibco	17105041	2U/ml, מתמוססים ב-PBS
קולגן סוג I	BD Biosciences	354249	בדרך כלל מזנב חולדה, הריכוז צריך להיות 3.5-4 מ"ג / מ"ל
24-באר מוסיף Nunclon	אנונימי	140629	גודל נקבוביות 8 מיקרומטר; יש להשתמש בתוספות עומדות ולא תלויות
מסננת תאים	BD בז	352360	צהוב
ג'נטמיצין	תרמו פישר סיינטיפיק	15750060	להתמוסס ב-PBS
מדיום קרטיניציטים של קרלייף	מערכות תאים		אין להוסיף FCS או אנטיביוטיקה
קולגנאז	סרווה	17454	ציון תקן NB4
קרטינוציטים אנושיים צעירים	מערכות תאים	FC-0007	חלופה להכנה עצמית מעורלת נעורים
פיברובלסטים אנושיים צעירים	מערכות תאים	FC-0001	חלופה להכנה עצמית מעורלת נעורים
EGF	טכנולוגיות החיים של Gibco	13247-051	יש להוסיף 10 נ"ג/מ"ל רק לייצור מדיום EGM
סידן כלורי	מרק כימיקלים	2381	הוסף 1.9 mM עבור הדור של EGM ו 3.8 mM עבור MM בינוני
חומצה סלנית	אלפא עזר	18851	הוסף 53 ננומטר לייצור מדיום EGM ו- MM
אינסולין	לילי	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל לייצור מדיום EGM ו-MM
אתנולמין	סיגמא-אולדריץ'	E-0135	הוסף 0.1 mM לייצור EGM ו- MM בינוני
P-אתנולמין	סיגמא-אולדריץ'	P-0503	הוסף 0.1 mM לייצור EGM ו- MM בינוני
הולו-טרנספרין	סיגמא-אולדריץ'	T-0665	הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל לייצור מדיום EGM ו-MM
תריודוטירונין	סיגמא-אולדריץ'	T-6397	הוסף 20 pM לייצור מדיום EGM ו- MM
הידרוקורטיזון	סיגמא-אולדריץ'	H-088816	הוסף 0.4 מיקרוגרם/מ"ל לייצור EGM ו-MM בינוני
פרוגסטרון	סיגמא-אולדריץ'	P-8783	הוסף 10 ננומטר רק לייצור מדיום EGM
Hepes	סיגמא-אולדריץ'	H-3784	הוסף 15 mM לייצור EGM ו- MM בינוני
סרין	סיגמא-אולדריץ'	S-4311	הוסף 1 mM לייצור מדיום EGM ו- MM
כולין כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	C-7017	הוסף 0.64 mM עבור הדור של EGM ו MM בינוני
dFCS	סיגמא-אולדריץ'	F-0392 פריט 086K0361	הוסף 2% עבור הדור של EGM ו MM בינוני
אדנין	סיגמא-אולדריץ'	A-9795	הוסף 0.18 mM לייצור EGM ו- MM בינוני
ל-גלוטמין	PromoCell	C-42209	הוסף 7.25 mM לייצור EGM ו- MM בינוני
סטרונציום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	255521	הוסף 1 mM לייצור מדיום EGM ו- MM