$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תאי B16-BL6
- מוציאים את לוחות תרבית התאים מאינקובטור 37 מעלות ומניחים אותם במכסה מנוע סטרילי. הצלחות צריכות להיות בערך 70% במפגש עם תאי מלנומה מורין B16-BL6. מפגש גדול יותר עשוי לשנות את הפוטנציאל הגרורתי של התאים.
- הוסף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לכל צלחת, תן לו לשבת במשך 1 דקות, ולאחר מכן לשאוף את הפתרון טריפסין-מדיה.
- מוסיפים 1 מ"ל טריפסין לצלחת ומחזירים צלחות לאינקובטור למשך 10 דקות.
- לאחר העברת הצלחות מהאינקובטור למכסה המנוע הסטרילי, הוסיפו 4 מ"ל של מדיום Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) ללא סרום לכל צלחת.
- אספו את התאים בעזרת פיפטה סטרילית וממונעת. מוציאים תאים לתחתית הצלחת, כשהקצה נלחץ בזווית קלה מאוד, כדי לפרק את התאים. חזור על הפעולה מספר פעמים כדי להבטיח הפרדה נאותה של גושי תאים, שאחרת עלולים לסתום את מחט הפליטה. לאסוף ולהעביר צינור חרוטי 50 מ"ל.
- השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע את צפיפות התא. שמירה על המספר הכולל של תאי B16-BL6 קבוע, לקבוע את נפח RPMI ללא סרום הדרוש כדי להגיע לריכוזים סופיים של 0, 0.065, 0.015, 0.25, ו 0.5 מיליון תאים / מ"ל.
- באותה מידה aliquot את התקשורת בצינור 50 מ"ל ל 15 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה את הצינורות החרוטיים ב 2,250 x גרם במשך 5 דקות. דקנט את התקשורת. הוסף נפח מתאים של RPMI ללא סרום ואשר את צפיפות התאים הרצויה באמצעות המוציטומטר. כוונן את הצפיפויות על ידי הוספת סל"ד נוסף או סיבוב והשהיה מחדש בנפח קטן יותר בהתאם.
- Aliquot 500 μL של כל תרחיף תא לתוך צינורות מסומנים 1.8 מ"ל על קרח.
2. הזרקת ורידים בזנב
- רכשו נקבות C57BL/6 עכברים (גיל 6-8 שבועות), 5 עכברים לקבוצה. המתינו מספר ימים להסתגלות העכברים.
- קח עכבר, המוחזק על ידי הזנב, והנחות אותו לאחור תחילה לתוך ריסון העכבר. כאשר פלג הגוף העליון נמצא בתא הראשי של הרסן והזנב מחוצה לו, משוך את העכבר לכיוון קצה הרסן. הכנס את בוכנת הרסן, והמשך לדחוף עד שהעכבר מאובטח.
- סובב את העכבר 90 מעלות כך שאחד מוורידי הזנב הרוחביים פונה כלפי מעלה. באמצעות כרית אלכוהול, נקה במרץ את הצד של זנב העכבר, במיוחד היכן שווריד הזנב גלוי ביותר.
הערה: תאורה טובה חיונית להדמיית ורידים יעילה של ורידי הזנב בעכברי B57BL/6J. מנורות חום או כריות ניתוח מחוממות, אמנם אין צורך, יסייעו גם על ידי הגדלת נפח וריד הזנב.
- בתרבית סטרילית, אספו 300 מיקרוליטר של מדיה של תרבית תאים מצינור 2 מיליון התאים / מ"ל. הופכים את המחט, מזיזים את הצד ודוחפים את הבוכנה, כדי להוציא בועות מהמזרק. יש להוציא תרבית-סל"ד כדי להגיע לנפח סופי של 250 μL.
- האריכו את זנב העכבר ביד הלא דומיננטית. החזק את הזנב כאשר הקצה הפרוקסימלי של הזנב מורם עם האצבע של היד הלא דומיננטית, ואת החלק הדיסטלי של הזנב מדוכא עם האגודל.
הערה: בדרך זו, וריד הזנב מוחזק במצב רוחבי, במקביל למשטח הרסן, עם כניסה תואמת אפשרית בחלק הדיסטלי יותר של הזנב.
- הכנס את המחט לווריד הזנב, לכיוון הקצה הדיסטלי, בזווית דקה כלפי מטה מלכתחילה, ולאחר מכן כוונן את המחט כך שתתאים לזווית וריד הזנב עם החדרה נוספת (הורדת קצה הבוכנה של המזרק ביחס למחט).
- הכנס את המחט כ 1 ס"מ לתוך וריד הזנב. לאחר החדרה, להתחיל לדחוף את הבוכנה, מחזיק את המחט יציב.
הערה: אם המחט נמצאת בווריד הזנב וקצה המחט אינו חסום, התקשורת צריכה לזרום ללא הפרעה לתוך הווריד. זריקה יעילה מאופיינת בפינוי דם מהווריד. אם יש התנגדות, או בועה מתחילה להיווצר באתר ההזרקה, להסיר את המחט ולנסות שוב במיקום קרוב יותר לאורך וריד הזנב.
- הסר את המחט מהווריד והשלך אותה. החזק גזה כנגד אתר הכניסה כדי לעצור כל דימום.
- הסר את הבוכנה מהמשענת והנח את העכבר בכלוב הנמען.
- חזור על הפעולה עבור כל הריכוזים האחרים.
הערה: הקמת מוקדי ריאות אורכת כשבועיים-שלושה, עם שונות בהתאם לקו התא ולגודל הרצוי של המוקדים. בינתיים, עכברים צריכים להיות במעקב עבור סימפטומים שיכולים להצדיק המתת חסד מוקדמת כמו התנשפות מוגזמת.
3. ספירת מוקדי הריאה
- הרדימו את העכבר על ידי הכנסתו לתא CO2 וחשיפתו ל-100%CO2 המוכנס ב-10-30% מנפח התא לדקה למשך 5 דקות. לאחר מכן יש לבצע פריקת צוואר הרחם.
- הפעל את העכבר על קלקר. בעזרת מספריים כירורגיים, ליצור חתך כירורגי לאורך עצם החזה.
- בצע שני חתכים נוספים, הן מראש חתך עצם החזה והן מסתעף לכיוון כתפי העכבר וחושף את כלוב הצלעות.
- בצע שני חתכים, כל אחד לאורך הצדדים הרוחביים של עצם החזה, כדי להסיר את כלוב הצלעות מפלג הגוף העליון, לחשוף את הריאות ואת הלב.
- מחזיק את הלב עם פינצטה כירורגית, לחתוך את הוושט ואת קנה הנשימה, לשחרר את הלב והריאות מן העכבר. הניחו מתחת למיקרוסקופ מנתח, בהגדלה של פי 10, להדמיה טובה יותר.
- מנתחים את הלב מהריאות ומסירים את בלוטת התימוס, ומשאירים רק את שתי הריאות.
- כאשר הריאות מתחת לטווח ניתוח, להתחיל לספור את מוקדי הריאות. כל מוקד צריך להופיע כבליטה עגולה, חומה על פני השטח של הריאות.
- לקבלת עקביות בין עכברים, ספרו את מספר המוקדים על פני האונה, ולאחר מכן הפכו את האונה. ביצוע כל אחת מארבע האונות בנפרד מאפשר ספירה קלה יותר.
- שמור ותקן את הריאות בעת ביצוע IHC, אחרת, להשליך את השרידים.