דגי HCR-DNA: טכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתרה לזיהוי DNA נגיפי בתאים נגועים

תקציר

מקור: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

בסרטון זה, התאים הנגועים בנגיפים של MCPyV היו נתונים לתגובת שרשרת הכלאה באתרם כדי לזהות גנומים ספציפיים של MCPyV. יתר על כן, טכניקת DNA-HCR שולבה עם FISH כדי לדמיין את הדנ"א MCPyV בתאי עור אנושיים נגועים.

פרוטוקול

1. זיהום

1. שמור על פיברובלסטים עוריים אנושיים ראשוניים ב- DMEM עם 10% נסיוב עגל עוברי, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו- 1% L-גלוטמין. עם ההגעה למפגש, פיצול פיברובלסטים 1:4 מבלי להסתובב כלפי מטה.
   הערה: לקבלת יעילות זיהום MCPyV הגבוהה ביותר, השתמש בפיברובלסטים ראשוניים בין מעברים 5 ו -12 המתחלקים באופן פעיל בזמן הציפוי.
2. כדי להדביק פיברובלסטים עוריים אנושיים, לשאוף את המדיום ולשטוף את התאים עם DPBS.
3. הוסיפו 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 5-10 דקות.
4. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים יורדים מהצלחת.
5. הוסף 10 מ"ל של מדיום DMEM/F12 המכיל 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF ו- 3 μM CHIR99021, שכולם מעוררים זיהום MCPyV, לצלחת והעבר את תמיסת התא לצינור של 15 מ"ל.
6. סובבו את התאים במהירות של 180 x גרם למשך 2 דקות והשליכו את הסופרנטנט. השהה מחדש את התאים בתווך DMEM/F12 המכיל 20 ננוגרם/מ"ל EGF, 20 ננוגרם/מ"ל bFGF ו- 3μM CHIR99021 ב- 2-4 x 10⁴ תאים למ"ל.
7. זרע 200 μL של תרחיף התא בתוספת 1 מ"ג / מ"ל collagenase סוג IV לתוך כל באר של צלחת 96 באר. הפשירו מניית ויריונים MCPyV על קרח. הוסף 10⁹ גנום נגיפי שווה ערך לנגיפים של נגיפים MCPyV לכל 1 מיקרוליטר של יודיקסנול עבור כל 2,500 עד 5,000 תאים נגועים. טפחו בעדינות על דופן הצלחת והניחו את הצלחת באינקובטור.
8. לאחר הדגירה ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך 48-72 שעות, להוסיף 20% FBS לכל באר.
9. אפשר את הזיהום להמשיך ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך 72-96 שעות.

2. In situ DNA-HCR

1. תקן תאים בתרבית על כיסויים עם 4% PFA ב- PBS למשך 10 דקות. שטוף את הכיסויים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן טפל בהם עם אתנול 70% כדי לחדור את התאים ב 4 ° C למשך הלילה.
   הערה: דגימות קבועות יכולות להישאר במצב זה במשך מספר ימים.
2. קדם-הכלאה של דגימות על ידי החלפת אתנול בחיץ הכלאה של בדיקה ודגרה במשך 60 דקות ב-RT.
3. לדלל את הגשושית (1 מיקרומטר) (טבלה 1) בתמיסת חיץ הכלאה של הגשושית בדילול 1:500 30 דקות לפני סוף שלב טרום ההכלאה ולדגור ב-45 מעלות צלזיוס.
4. בסוף הדגירה, פיפטה ~ 10 μL של תערובת הבדיקה המדוללת לכל כיסוי על שקופיות מיקרוסקופ. הניחו את הכיסויים, בצד התא כלפי מטה, על הטיפות המתאימות של תערובת בדיקת ההכלאה. אטמו את הקצוות והגב של הכיסויים למגלשות עם כמות נדיבה של מלט גומי.
5. חממו את המגלשות עם בדיקות נוספות בטמפרטורה של 94°C למשך 3 דקות על ידי הצבת המגלשות בצד השטוח של בלוק חום. מעבירים את המגלשות לתא לח ודגורים על 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כדי ליצור תא לח פשוט, הרטיבו קלות מגבות נייר סטריליות עם dH₂O והניחו אותן בתחתית מיכל פלסטיק שאוטם באטם גומי.
   הערה: במהלך החימום, מלט הגומי יכול לבעבע לזמן קצר. עם זאת, ודא כי האטם אינו נשבר.
6. מקלפים בזהירות את מלט הגומי בעזרת מלקחיים ומניחים את הכיסויים בצד התא בחזרה לבארות של צלחת בת 24 בארות. שטפו את הכיסויים עם חיץ שטיפת בדיקה ב-RT שלוש פעמים.
7. יש לדגור על הכיסוי במאגר ההגברה (200 μL בלוחות 24 בארות) ב-RT למשך 30-60 דקות.
8. בינתיים, יש לשלול כל אחת משתי סיכות השיער האוליגונוקלאוטידים המסומנות כמזהות את הגשושיות (טבלה 1) בצינורות PCR נפרדים על ידי חימום ל-94°C למשך 90 שניות וקירור ל-RT למשך 30 דקות תוך הגנה מפני אור. מערבבים את שתי סיכות הראש בחיץ הגברה, כל אחת בדילול של 1:50.
9. צור משטח לתגובת ההגברה על ידי מתיחה של סרט פרפין על פני הפנים הפתוחות של מכסה צלחת 24 בארות. פיפטה 50-100 μL טיפות של תערובת חיץ סיכת הראש/הגברה על סרט הפרפין עבור כל כיסוי. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את הכיסויים מתמיסת טרום ההגברה. יבשו את הכיסוי על ידי נגיעה בקצה המגבון החד פעמי הנקבובי, והניחו את צד התא כלפי מטה על טיפת ההגברה.
10. הניחו את מכסה הצלחת המחזיק את הכיסויים לתוך תא לח ודגרו למשך הלילה ב-RT בחושך.
11. החזירו את הכיסויים לבארות פעם נוספת. דגרו על הדגימות עם 5x SSCT [5x נתרן כלורי נתרן ציטראט (SSC) 0.1% Tween 20 מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר] המכיל 0.5 מיקרוגרם/מ"ל DAPI למשך שעה אחת ב-RT. שטפו את הדגימות פעמיים עם 5x SSCT ב-RT.
12. הרכיבו את הכיסויים על שקופיות מיקרוסקופ. נתחו את התאים ודמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

בדיקת MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctctaaggagtggtttttattatgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagccttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgcggagaaggaccacccagagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgaatggaggaggggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttttgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcgggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
בדיקת HPV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

טבלה 1: בדיקות ששימשו במחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חיץ הכלאה של בדיקה	טכנולוגיות מולקולריות
חיץ שטיפת בדיקה	טכנולוגיות מולקולריות
מאגר הגברה	טכנולוגיות מולקולריות
Alexa 594-labeled hairpins	טכנולוגיות מולקולריות	B4	הגנה מפני אור
Paraformaldehyde	Sigma	P6148